一、肝細(xì)胞死亡的發(fā)生機(jī)制

　　肝細(xì)胞死亡超過了肝臟的再生能力，即會(huì)發(fā)生肝衰竭。經(jīng)典的肝細(xì)胞死亡模式分為兩類，即壞死與凋亡。壞死往往繼發(fā)于各種肝損傷所導(dǎo)致的ATP 耗竭，細(xì)胞腫脹溶解，導(dǎo)致胞內(nèi)容物的釋放和繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生。凋亡為ATP 依賴的程序性細(xì)胞死亡方式，其細(xì)胞因皺縮而獨(dú)立出來，染色質(zhì)固縮，DNA 斷裂成規(guī)律性片段，并被胞膜包繞形成凋亡小體，后者可由鄰近巨噬細(xì)胞吞噬，以最大限度的減輕細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏和炎癥反應(yīng)。長期以來，壞死與凋亡被認(rèn)為是兩種截然不同的現(xiàn)象，但在肝臟病理中我們可以觀察到肝細(xì)胞的壞死與凋亡是并存的。研究證據(jù)提出新的觀點(diǎn)，壞死與凋亡是源于相同啟動(dòng)因素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同的細(xì)胞死亡方式，這一過程被命名為壞死性凋亡。

　　細(xì)胞腫脹是壞死早期最為顯著的特征。在ATP 耗竭后，肝細(xì)胞骨架蛋白的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促成漿膜大泡的形成。隨即出現(xiàn)以線粒體去極化、溶酶體破裂、雙向陰離子熒光團(tuán)泄漏及漿膜大泡腫脹加劇為特征的亞穩(wěn)態(tài)。該狀態(tài)持續(xù)幾分鐘后漿膜大泡破裂，導(dǎo)致漿膜滲透壓屏障不可逆的損傷，各種跨膜電子、離子梯度的斷裂，以及溶質(zhì)酶和代謝中間產(chǎn)物的滲漏，最終細(xì)胞失去活性。與其它高需氧的組織器官類似，肝臟對供血不足引起的損傷極為敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻斷時(shí)，整個(gè)肝臟將處于缺氧狀態(tài)。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以滿足氧需時(shí)，肝小葉中央?yún)^(qū)域而非周邊區(qū)域?qū)l(fā)生缺氧。由于肝臟具有雙重血供系統(tǒng)，由低流量性缺氧造成的中央?yún)^(qū)域肝細(xì)胞的壞死是更為常見的現(xiàn)象。

　　缺血-再灌注損傷發(fā)生于肝臟的缺血-再灌注損傷可分為兩個(gè)階段，第一階段反映了直接的肝細(xì)胞損傷，第二階段則涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝臟枯否氏細(xì)胞的活化，以及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的炎性浸潤。目前認(rèn)為，當(dāng)缺血、缺氧發(fā)生時(shí)，由于ATP 通過氧化磷酸化途徑的合成障礙，肝臟細(xì)胞基本喪失活力，但隨之發(fā)生的酸中毒會(huì)使細(xì)胞的壞死延遲數(shù)個(gè)小時(shí)，直至再灌注完成后，組織的pH 值恢復(fù)正常，細(xì)胞即發(fā)生腫脹壞死。多項(xiàng)研究表明，在經(jīng)歷熱缺血或冷缺血后，肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞對pH 值依賴的壞死途徑極其敏感。在肝細(xì)胞的體外熱缺血-再灌注損傷模型中，通過共聚焦顯微鏡觀察到在pH 值修復(fù)后，大量MPT 通道被誘導(dǎo)開放，線粒體發(fā)生嚴(yán)重腫脹。隨后在Caspase 級聯(lián)反應(yīng)激活之前，ATP 即已耗竭并引發(fā)肝細(xì)胞急劇腫脹壞死。體內(nèi)肝臟發(fā)生缺血-再灌注損傷后，其急性階段也主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞的壞死，組織學(xué)評價(jià)凋亡細(xì)胞的發(fā)生率僅為2%.但也有其他的觀點(diǎn)認(rèn)為缺血-再灌注損傷后，肝細(xì)胞的凋亡和壞死是并存的，損傷的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間決定了細(xì)胞的死亡方式，即嚴(yán)重的損傷會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)生的肝細(xì)胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反應(yīng)。

　　免疫凝血途徑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞的廣泛壞死、網(wǎng)狀支架塌陷及大量炎性細(xì)胞浸潤是重型病毒性肝炎的主要病理學(xué)改變，此外其肝竇及血管腔內(nèi)廣泛微小血栓的形成也是值得我們關(guān)注的又一病理生理學(xué)特征。本研究組即針對這一特征經(jīng)過深入系統(tǒng)的研究，克隆到與微循環(huán)障礙和肝細(xì)胞壞死密切相關(guān)的新的凝血酶原酶分子——fgl2 凝血酶原酶。fgl2 凝血酶原酶屬于纖維蛋白原超家族，由活化巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪福瑥亩焖賳?dòng)凝血過程，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促進(jìn)血栓形成。研究發(fā)現(xiàn)fgl2 凝血酶原酶在人或小鼠重型病毒性肝炎的外周血PBMC 和肝組織中均有特異性的高表達(dá)，并與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)。提示活化巨噬細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）/fgl2凝血酶原酶介導(dǎo)的免疫凝血途徑可通過促進(jìn)肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的微循環(huán)障礙，最終肝細(xì)胞缺血缺氧，ATP 合成障礙而觸發(fā)肝細(xì)胞壞死的發(fā)生。至此，fgl2 凝血酶原酶的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)研究對重型病毒性肝炎肝細(xì)胞壞死的分子機(jī)制提出了全新的見解，也為指導(dǎo)臨床預(yù)測患者轉(zhuǎn)歸、判斷治療效果，開辟新的藥物和基因治療途徑提供了理論基礎(chǔ)和靶目標(biāo)。

　　2. 凋亡

　　凋亡的觸發(fā)分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑，均通過激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)來啟動(dòng)凋亡程序。死亡受體/配體通路在凋亡誘導(dǎo)的外源性途徑中占有重要地位，以DNA 損傷、p53 基因激活為代表的氧化應(yīng)激反應(yīng)則是內(nèi)源性凋亡途徑的始動(dòng)因素。死亡受體屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體超家族，為包括胞外配體結(jié)合區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域三大部分的跨膜蛋白。目前認(rèn)為在肝臟發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括Fas、TNF-R1 、TRAIL-R1/ TRAIL-R2 等，后者與相應(yīng)的配體FasL、TNF-α 和TRAIL 結(jié)合后可誘導(dǎo)受體發(fā)生寡聚化并激活，其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的連接蛋白相互作用進(jìn)而觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。

　　Bcl2 家族蛋白，包括促凋亡因子與抗凋亡因子，是控制線粒體釋放致凋亡因子的主要調(diào)節(jié)因素。作為Bcl-2 家族中促凋亡BH3-only 蛋白亞類的成員之一，Bid 蛋白在胞漿可被Caspase8 酶切激活形成tBid 并轉(zhuǎn)位至線粒體，最終通過含多個(gè)死亡區(qū)域的促凋亡因子Bax/Bak 直接與線粒體作用，影響其外膜的通透性、細(xì)胞色素 C 及其它促凋亡因子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。抗凋亡因子諸如Bcl-2、Bcl-xL 及Mcl-1 等則可能通過與Bax 及Bak 形成異源性二聚體阻斷凋亡效應(yīng)的發(fā)生。

　　2.1 Fas/Fas-L 途徑

　　Fas 在肝細(xì)胞具有廣泛的表達(dá)，主要定位于高爾基復(fù)合體及其反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在經(jīng)歷毒性物質(zhì)如膽汁酸刺激后，大量Fas 會(huì)轉(zhuǎn)位至肝細(xì)胞漿膜。人或小鼠肝細(xì)胞在給予拮抗性Fas 抗體后會(huì)出現(xiàn)大面積的凋亡。在暴發(fā)性肝衰竭患者中，亦可觀察到肝細(xì)胞Fas 的強(qiáng)陽性表達(dá)，肝臟炎性浸潤淋巴細(xì)胞、外周淋巴細(xì)胞上Fas-L 及血清可溶性Fas-L 水平的大量上調(diào)。體外研究表明，增加的銅載量可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，而抗Fas-L 中和性抗體能起到一定的干預(yù)作用，提示了Fas/Fas-L 途徑在Wilson‘s 疾病中的作用。在HELLP 綜合征（溶血、肝酶升高和低血小板計(jì)數(shù)）中，有證據(jù)發(fā)現(xiàn)源于胎盤的Fas-L 是誘導(dǎo)肝損傷的始動(dòng)因素。此外，F(xiàn)as/Fas-L 途徑在酒精性肝炎、多種藥物誘導(dǎo)的急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中亦占有重要的地位。

　　2.2 TNF-α/TNF-R1 信號

　　正常肝細(xì)胞中TNF-R1 的表達(dá)水平很低，但各種急慢性肝臟疾病中，TNF-R1 會(huì)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞和炎性浸潤細(xì)胞中大量表達(dá)。TNF-α 信號途徑與Fas-L 信號途徑具有交叉重疊之處，包括Caspase8 的激活、Bid 的切割以及細(xì)胞色素C 的釋放等。不同之處在于除了誘導(dǎo)凋亡途徑，TNF-α還能通過核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）依賴的基因表達(dá)途徑促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，在肝細(xì)胞的再生中起重要作用。研究表明，NF-кB 可通過下調(diào)c-Jun 氨基端激酶（JNK）與激活蛋白1（AP-1）來抵御TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。TNF-α 誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇則具有抑制JNK 鈍化磷酸酶的功能，可促進(jìn)JNK 途徑的持續(xù)活化，細(xì)胞色素C 的釋放及Caspase3 的激活?？寡趸委熌軌蜃钄郥NF-α 誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭，但不影響肝細(xì)胞的再生功能。目前關(guān)于TNF-α 在人與小鼠暴發(fā)性肝衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用已有相當(dāng)?shù)年U述， TNF-α 被認(rèn)為是缺血性肝損傷中肝細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素。在酒精性肝炎患者中，其血清中TNF-α 與TNF-R1 的水平亦顯著升高并與患者死亡率相關(guān)。

　　2.3 TRAIL 配體/TRAIL 受體

　　盡管TRAIL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑已被闡明，但其是否與Fas-L、TNF-α 途徑一樣在急性肝衰竭的疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用尚不明確。體內(nèi)外研究表明正常肝細(xì)胞對于TRAIL 介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)耐受，而慢性病毒感染、脂肪變性及毒性物質(zhì)的刺激卻可上調(diào)肝細(xì)胞TRAIL 的表達(dá)，進(jìn)而通過TRAIL 配體/受體系統(tǒng)特異性清除病毒感染的肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。TRAIL 配體/受體途徑對于肝細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)凋亡的作用為病毒性肝炎與肝膽管系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

　　3. 壞死性凋亡

　　線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞壞死與凋亡的調(diào)控中心。尤其對于肝細(xì)胞，其死亡受體介導(dǎo)的Caspase8 活化不能達(dá)到很高的水平，凋亡信號需要借助線粒體途徑細(xì)胞色素C 的釋放來放大。細(xì)胞色素C 的釋放機(jī)制尚存爭議，MPT 是公認(rèn)的重要途徑之一。缺血/再灌注損傷、死亡受體激活，以及活性氧簇均能促進(jìn)MPT 的開放，后者可引發(fā)線粒體去極化與氧化磷酸化解耦聯(lián)過程，線粒體發(fā)生嚴(yán)重腫脹至外膜破裂釋放細(xì)胞色素C 至胞液。細(xì)胞色素C 再與凋亡誘導(dǎo)因子-1 相互作用順序激活Caspase9 及Caspase3.這一過程中，ATP是決定壞死或凋亡發(fā)生的關(guān)鍵因素。當(dāng)再灌注損傷導(dǎo)致廣泛的MPT 快速發(fā)生并累及多數(shù)線粒體時(shí)，細(xì)胞ATP 濃度很快下降至耗竭，肝細(xì)胞凋亡途徑被阻斷而發(fā)生壞死。在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭中，如果消耗的ATP 能夠通過糖酵解途徑得以補(bǔ)償并足以激活特異性蛋白酶時(shí)，細(xì)胞的凋亡反應(yīng)被誘導(dǎo)，反之則發(fā)生壞死。因此，現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為，壞死與凋亡是源于相同啟動(dòng)因素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的可以相互轉(zhuǎn)化的兩種細(xì)胞死亡方式，即壞死性凋亡，線粒體功能損傷在這一過程中起到關(guān)鍵的連接作用。

　　二. 重型肝炎的分子免疫治療

　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)特別是基因工程學(xué)的發(fā)展，分子免疫（重點(diǎn)介紹基因治療）治療作為治療新策略，已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。基因治療是將具有治療價(jià)值的基因分子通過載體導(dǎo)入人體細(xì)胞中，直接進(jìn)行表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，以達(dá)到防治或減輕疾病的目的?；蛑委煹闹饕獑栴}是尋找一種合適的載體特異有效地將目的基因輸送到靶細(xì)胞，在重型肝炎的基因治療中常用腺病毒作為載體，這主要是因?yàn)橄俨《据d體對肝臟具有親嗜性，能介導(dǎo)目的基因主要在肝臟表達(dá)從而發(fā)揮作用。重型肝炎的基因治療策略主要有以下三個(gè)方面：

　?。?）基因水平上抑制肝細(xì)胞的凋亡：上述大量研究表明，免疫學(xué)異常是重型肝炎發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)，而TNFα和FasL 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡則是其中的重要通路，如果能調(diào)控上述分子的表達(dá)，就有可能控制重型肝炎的免疫病理過程，抑制肝細(xì)胞的凋亡。Song E 等利用近年來新興起的RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)合成針對Fas 的siRNA，在抗Fas 抗體誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎模型中，尾靜脈高壓注射（hydrodynamictail vein injection）Fas siRNA，結(jié)果表明，治療組82%的暴肝小鼠存活超過10 天，對照組三天內(nèi)全部死亡。治療組小鼠肝組織損傷明顯減輕，肝細(xì)胞凋亡及炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞中Fas mRNA水平降低，F(xiàn)as 蛋白表達(dá)減少。

　?。?）調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子的表達(dá)：Nakayama Y 等人將腺病毒編碼的CTLA-4Ig （AdCTLA-4Ig） 注入LPS 誘導(dǎo)的暴肝小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠全部存活，肝出血性損傷及血清轉(zhuǎn)氨酶顯著降低，CD4+ T 細(xì)胞活化功能受到抑制，肝臟中γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）及白介素12（interleukin-12，IL-12）等細(xì)胞因子的表達(dá)降低，該實(shí)驗(yàn)表明導(dǎo)入AdCTLA-4Ig可調(diào)節(jié)暴發(fā)性肝炎小鼠體內(nèi)IFN—γ、IL-12 等細(xì)胞因子的表達(dá)，有利于肝損傷的恢復(fù)。

　?。?）阻斷凝血級聯(lián)反應(yīng)：研究證明纖維介素蛋白（又稱fgl2 凝血酶原酶，fibroleukin/fibrinogen-likeprotein 2， fgl2）能直接激活凝血酶原啟動(dòng)凝血過程，通過對重型肝炎患者和動(dòng)物模型的研究，發(fā)現(xiàn)在重型肝炎過程中，肝內(nèi)枯否細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)fgl2 激活凝血酶，導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死[38~40].本實(shí)驗(yàn)室通過構(gòu)建mfgl2 反義質(zhì)粒成功阻斷了鼠3 型肝炎病毒（mouse hepatitis virus type 3，MHV-3）誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠體內(nèi)mfgl2 的表達(dá)水平，減輕了小鼠肝組織病理損傷，減少炎性細(xì)胞的浸潤和纖維蛋白的沉積，使小鼠生存率提高了33.3%.隨著重型肝炎分子機(jī)制研究的不斷深入，從分子水平上治療重型肝炎成為了一種全新的治療方法，其治療效果在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上得到體現(xiàn)。但基因治療在研究和實(shí)踐中還存在著若干問題：如導(dǎo)入基因的穩(wěn)定表達(dá)問題，導(dǎo)入基因的安全性問題，基因治療的靶向性問題，等等，可見基因治療若用于臨床，同樣有一段很長的路要走。