隨著生物技術(shù)的發(fā)展,核酸檢測(cè)得到了人們?cè)絹?lái)越多的重視,它可直接檢查HIV RNA,可在發(fā)現(xiàn)血清學(xué)變化之前檢測(cè)HIV感染,而且比P24抗原檢測(cè)方法更靈敏[16]。

多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)法

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93 ℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 ℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。

③ 引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成1條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個(gè)循環(huán)需2～4 min， 2～3 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。檢測(cè)HIV?RNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可，這樣的反應(yīng)稱為RT－PCR。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

本技術(shù)的原理是使用熒光基團(tuán)標(biāo)記探針,5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)R,3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Q,在沒(méi)有PCR擴(kuò)增時(shí),由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離很近,使熒光基團(tuán)被淬滅,不發(fā)熒光;而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí),引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時(shí)結(jié)合在模板上,熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的5′?3′外切酶活性,將熒光探針?biāo)?熒光基團(tuán)被釋放出來(lái),由于在空間上與淬滅基團(tuán)分開(kāi),則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測(cè)到,一邊擴(kuò)增,一邊檢測(cè),這樣就實(shí)現(xiàn)了“實(shí)時(shí)”檢測(cè)。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決了PCR污染問(wèn)題等特點(diǎn)[17]。

支鏈DNA檢測(cè)法——bDNA

bDNA是定量檢測(cè)血漿中的HIV?1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段,在其每個(gè)側(cè)鏈上都可以標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物。將HIV的RNA通過(guò)離心從病毒顆粒中釋放出來(lái),然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合,又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針?lè)謩e與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成了HIVRNA?寡核苷酸復(fù)合物。再加入1種化學(xué)發(fā)光底物孵育后可放大化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過(guò)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量,因?yàn)榘l(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染,這較PCR是一大進(jìn)步。bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針,可以方便地檢測(cè)HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR，提高bDNA靈敏度是一大難點(diǎn)[18]。

核酸序列依賴性擴(kuò)增法(nucleic acid sequence based amplification, NASBA) NASBA是由一對(duì)引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)。反應(yīng)在 42 ℃進(jìn)行 ,可在 2 h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進(jìn)行擴(kuò)增[15]。整個(gè)反應(yīng)分非循環(huán)相和循環(huán)相:在非循環(huán)相中,引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA退火, 在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第2條DNA互補(bǔ)鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經(jīng)其啟動(dòng)子序列起動(dòng)而轉(zhuǎn)錄RNA，RNA又可在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成DNA，進(jìn)入循環(huán)相,對(duì)模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)(transcription mediated amplification, TMA)TMA技術(shù)原理與NASBA基本一致，略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應(yīng)在 41.5 ℃進(jìn)行 ,可在 1 h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約 109倍。

連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)

LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴(kuò)增技術(shù)，是繼PCR后新發(fā)展的一種較有前景的體外擴(kuò)增技術(shù)。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交,當(dāng)該2段DNA探針與沒(méi)有發(fā)生突變的模板褪火后,如果2探針是緊鄰的,中間沒(méi)有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來(lái),連接以后的新鏈又可以作為模板,引導(dǎo)下一周期的連接產(chǎn)生新的子鏈。若連接區(qū)段發(fā)生核苷酸的堿基突變,則連接反應(yīng)不能發(fā)生,擴(kuò)增反應(yīng)終止。