摘要目的：觀察組織塊原代培養(yǎng)法是否可用于涎腺肌上皮細(xì)胞發(fā)育分化的研究，并探討肌上皮細(xì)胞的組織發(fā)生。方法：采用組織塊原代培養(yǎng)法，通過相差顯微鏡、透射電鏡及免疫組化染色等檢測手段，對(duì)不同時(shí)期大鼠頜下腺肌上皮細(xì)胞進(jìn)行研究。結(jié)果：肌上皮樣細(xì)胞及含有分泌顆粒的分泌細(xì)胞見于體外培養(yǎng)第3d.肌微絲及Actin陽性細(xì)胞分別最早出現(xiàn)于培養(yǎng)第6d和7d.此結(jié)果與體內(nèi)研究結(jié)果相一致。結(jié)論：肌上皮細(xì)胞可能來源于上皮干細(xì)胞；體外組織塊培養(yǎng)方法亦適用于細(xì)胞分化研究。

　　關(guān)鍵詞肌上皮細(xì)胞分化體外培養(yǎng)

　　目前，有關(guān)涎腺體外原代培養(yǎng)的研究很多，并建立了一些培養(yǎng)方法，但有關(guān)涎腺發(fā)育分化的體外研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊原代培養(yǎng)法，通過相差顯微鏡、透射電鏡及免疫組化染色等檢測手段，對(duì)胚胎17、18、19、20、21d及生后1、5、10、15、20d大鼠頜下腺肌上皮細(xì)胞進(jìn)行研究。其目的在于：（1）觀察組織塊原代培養(yǎng)法是否可用于涎腺肌上皮細(xì)胞發(fā)育分化的研究；（2） 其發(fā)育分化是否與體內(nèi)研究同步；（3）探討肌上皮細(xì)胞的組織發(fā)生。

　　材料與方法

　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　選用150～250g健康Wistar雄性和雌性大鼠使之交配，次日晨將雌鼠陰道分泌物涂片，查到精子之日即作為受孕之零日，從此日算起，至胚胎發(fā)育17d取出位于胎鼠頸部的頜下腺組織。

　　二、厚膠及薄膠的制備

　　1. 厚膠制備：取大鼠尾腱1g，剪碎，70%乙醇消毒，干燥，溶于1∶1000醋酸，消化，離心，上清用作儲(chǔ)存液。厚膠的配制方法為：儲(chǔ)存液：10×培養(yǎng)液∶0.34M∶NaOH=8∶1∶1.24孔板內(nèi)預(yù)先放置處理好的蓋片，把配好膠鋪于其內(nèi)。

　　2. 薄膠制備：按常規(guī)方法制備鼠尾膠原，用吸管將膠原均勻涂于培養(yǎng)瓶生長面的內(nèi)壁。

　　三、組織塊培養(yǎng)法

　　在無菌條件下，取胚胎17天大鼠頜下腺，剪碎至1mm3小塊，將小塊組織分別接種于預(yù)先放置的鋪有厚膠或薄膠蓋玻片的24孔板中。用含有10%小牛血清、10ng/ml EGF、5μg/ml胰島素、50ng/ml氫化考地松、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　四、相差顯微鏡觀察

　　每日用相差顯微鏡觀察大鼠頜下腺上皮細(xì)胞生長情況。同時(shí)取相應(yīng)天數(shù)生長良好的細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察及免疫組化染色。

　　五、透射電鏡觀察

　　無菌條件下，取培養(yǎng)于厚膠上的頜下腺細(xì)胞，48h后取出細(xì)胞生長較好的蓋玻片，定為胚胎17d，依次取出相對(duì)應(yīng)于體內(nèi)胚胎18、19、20、21d及出生后1、5、15、20d培養(yǎng)的大鼠頜下腺細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定，常規(guī)脫水、包埋、定位、垂直于細(xì)胞表面切片、染色、透射電鏡觀察。

　　六、免疫組織化學(xué)染色

　　無菌條件下，取培養(yǎng)于薄膠上的頜下腺細(xì)胞。取片情況同電鏡觀察。固定于甲醇：丙酮（1∶1）溶液中，用特異性抗體肌動(dòng)蛋白（Actin），采用ABC法進(jìn)行免疫組化染色。

　　結(jié)果

　　一、相差顯微鏡觀察

　　體外培養(yǎng)胚胎17d細(xì)胞，48h后可見上皮細(xì)胞長出，為多邊形或圓形，連接成片，有較多圓形細(xì)胞具有核分裂現(xiàn)象。

　　二、透射電鏡觀察

　　電鏡觀察提示體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育比體內(nèi)延遲24～36h.培養(yǎng)3～4d（相對(duì)應(yīng)于體內(nèi)胚胎18～19d），肌上皮樣細(xì)胞出現(xiàn)。核大、不規(guī)則。胞漿內(nèi)見一些球形線粒體和擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及具有活力的高爾基復(fù)合體。胞漿突少而短。同時(shí)出現(xiàn)含有分泌顆粒的腺上皮細(xì)胞。培養(yǎng)第6d，肌上皮細(xì)胞內(nèi)可見少量肌微絲、吞飲小泡及豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和散在的線粒體，相鄰細(xì)胞以胞漿突互相相嵌，連接較緊密（圖1）。培養(yǎng)第7d，肌上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見肌微絲束及大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基復(fù)合體及胞膜內(nèi)側(cè)的吞飲小泡。并在部分區(qū)域見到基底板樣物。培養(yǎng)第11d，肌上皮細(xì)胞數(shù)量增加，肌微絲束數(shù)量增多。胞漿突細(xì)長、彎曲且有分支。培養(yǎng)第16d，肌上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)肌微絲明顯增多，并可見密體出現(xiàn)。細(xì)胞器數(shù)目減少。培養(yǎng)第21d，肌上皮細(xì)胞內(nèi)含大量肌微絲束，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，吞飲小泡增多，相鄰細(xì)胞間橋粒數(shù)目增加，細(xì)胞連接緊密。培養(yǎng)第26d，肌上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)含有豐富的肌微絲束，沿細(xì)胞長軸分布，細(xì)胞器數(shù)量減少（圖2）。在胚胎發(fā)育過程中，尚可見一些形態(tài)介于導(dǎo)管和肌上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞。

圖1　肌上皮樣細(xì)胞培養(yǎng)第6天，電鏡觀

圖2　肌上皮樣細(xì)胞培養(yǎng)26天，電鏡觀

　　三、免疫組化染色

　　選用肌上皮細(xì)胞特異性的抗體Actin進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果表明，生后1d最早出現(xiàn)Actin陽性細(xì)胞，細(xì)胞為短梭形，胞核較大，胞漿著色。該細(xì)胞數(shù)量少且呈弱陽性（圖3）。生后15d，Actin陽性細(xì)胞明顯增多（圖4）。生后20d，Actin陽性細(xì)胞數(shù)量多，有些區(qū)域細(xì)胞聚集成團(tuán)，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。

圖3　生后1天，Actin陽性肌上皮細(xì)胞

圖4　生后15天，Actin陽性肌上皮細(xì)胞

　　討論

　　體外培養(yǎng)第3d（相當(dāng)于體內(nèi)胚胎18d）的頜下腺上皮細(xì)胞，電鏡下可見肌上皮樣細(xì)胞及含有分泌顆粒的分泌細(xì)胞。培養(yǎng)第6d，肌上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量肌微絲，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和較豐富的線粒體。培養(yǎng)第7d，免疫組化染色最早發(fā)現(xiàn)Actin陽性細(xì)胞。培養(yǎng)21d，肌上皮細(xì)胞數(shù)量明顯增多，肌微絲數(shù)量也明顯增加。培養(yǎng)第26d，肌上皮細(xì)胞數(shù)量多，胞漿內(nèi)含有豐富的肌微絲，免疫組化染色顯示肌上皮細(xì)胞聚集成團(tuán)，且呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。Line和Archer［1］的免疫組化研究結(jié)果表明，actomyosin陽性細(xì)胞最初出現(xiàn)于生后1d.莜原正德［2］通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胚胎18d的大鼠頜下腺中可見肌上皮樣細(xì)胞。胚胎21d和生后1天可見少量的微絲。王潔等［3］免疫電鏡研究亦表明Actin在正常肌上皮中為陽性反應(yīng)。 本研究的結(jié)果與他們的觀察結(jié)果基本一致。且電鏡觀察與免疫組化染色結(jié)果相符，與我們體內(nèi)研究結(jié)果相一致。說明體外組織塊培養(yǎng)方法亦適用于細(xì)胞分化研究。

　　國外，體外胚胎發(fā)育的研究多采用器官培養(yǎng)方法。這樣可以更接近體內(nèi)的發(fā)育分化情況。Culter等［4］選用胚胎16天的大鼠頜下腺進(jìn)行器官培養(yǎng)，觀察到肌上皮細(xì)胞位于基底膜與腺上皮細(xì)胞之間，生長發(fā)育情況類似體內(nèi)，只是比體內(nèi)延遲24～36h.但器官培養(yǎng)要求較高的培養(yǎng)條件。因此，我們根據(jù)現(xiàn)有的條件，采用可促進(jìn)細(xì)胞極性分化且較長時(shí)間生存的膠原膠，配合有利于上皮細(xì)胞生長的培養(yǎng)液，選用組織塊培養(yǎng)法對(duì)大鼠頜下腺進(jìn)行培養(yǎng)。由于培養(yǎng)的組織塊是從供體獲取后的首次培養(yǎng)，剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性。在一定程度上保持其原有組織結(jié)構(gòu)，有利于適應(yīng)體外環(huán)境，上皮與間質(zhì)可相互誘導(dǎo)，更易反映體內(nèi)狀態(tài)。且操作簡便，適用于組織量較少的培養(yǎng)，如本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠胚胎17d頜下腺組織，體積非常小，每個(gè)腺體體積僅為約1mm3.只是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)組織塊法體外培養(yǎng)的細(xì)胞排列的方式不如器官培養(yǎng)那樣接近體內(nèi)。

　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肌上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多位于分泌性上皮細(xì)胞之間，以橋粒與分泌性上皮細(xì)胞相連。部分區(qū)域也可見肌上皮細(xì)胞直接與基底板樣物接觸。Cutler等［5］在培養(yǎng)大鼠頜下腺時(shí)可觀察到基底板樣物的存在。有研究表明肌上皮細(xì)胞可產(chǎn)生基底膜成分中的某些蛋白，如層連蛋白、IV型膠原、纖維粘連蛋白等［6］。Warburton等［7］研究結(jié)果表明肌上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞均可產(chǎn)生膠原（主要為IV型膠原），且肌上皮細(xì)胞膠原的產(chǎn)量是上皮細(xì)胞的5倍。這些細(xì)胞外基質(zhì)的成份的表達(dá)和產(chǎn)生，是由細(xì)胞生長的底物所調(diào)節(jié)的。因此說明細(xì)胞周圍的間質(zhì)（如本實(shí)驗(yàn)采用的Ⅰ型膠原）可影響基底膜的合成和/或分解［8］。有研究將已出現(xiàn)分支形態(tài)但無腺細(xì)胞分化的大鼠頜下腺的始基在體外行器官培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型膠原抗體。結(jié)果表明所有這些抗體均抑制始基的形態(tài)的繼續(xù)形成和腺細(xì)胞的分化，表明間質(zhì)性膠原（Ⅰ，Ⅲ型）和基底膜膠原（Ⅳ型）在涎腺形態(tài)發(fā)生中均起重要調(diào)節(jié)作用［9］。

　　一般胚胎器官發(fā)生和細(xì)胞的分化是一個(gè)連續(xù)的過程，提示這兩個(gè)過程發(fā)生的機(jī)制具有相關(guān)性。然而，器官發(fā)生并不限定細(xì)胞分化的表型。本實(shí)驗(yàn)觀察肌上皮細(xì)胞的的發(fā)育分化也多屬于此種情況，觀察表明，腺體器官發(fā)生和細(xì)胞的分化是部分相關(guān)的，各自有獨(dú)立的調(diào)控機(jī)制。

　　關(guān)于肌上皮細(xì)胞的來源目前尚有分歧，但越來越多的證據(jù)支持Brown等提出的序列分化模式。這主要是雙潛能前體細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。Shirasuna［10］1986年發(fā)現(xiàn)在涎腺導(dǎo)管系統(tǒng)存在至少能雙向分化的干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)肌上皮細(xì)胞與分泌細(xì)胞是同時(shí)發(fā)生的，位于基底板內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞其形態(tài)介于肌上皮細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞之間。有研究已克隆了這種中間細(xì)胞，認(rèn)為可能為體外培養(yǎng)時(shí)上皮細(xì)胞向肌上皮細(xì)胞的分化階段和體內(nèi)的終末導(dǎo)管結(jié)構(gòu)。故提示發(fā)育中的涎腺具有共同的上皮性干細(xì)胞可多向分化，可分化為肌上皮細(xì)胞、腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞。此推測與Tsukada T等的結(jié)論相同。

　　作者單位：長春市（130041）白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

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