【關鍵詞】  腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細胞凋亡；梗塞，大腦中動脈；大鼠

　　Expression of extracellular signalregulated kinase in focal cerebral ischemia

　　ZHANG XiaoYan， YANG JinSheng， GU YouQuan， SHI XiangQun

　　Department of Neurology， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Uilitary Area Command， Lanzhou 730050， China， Clinical Medical School， Lanzhou Mniversity， Lanzhou 730000， China

　　【Abstract】  AIM： To study the role of extracellular signalregulated kinase （ERK） during focal cerebral ischemiareperfusion in hippocampal neurons of rats. METHODS： Sixty male adult Wistar rats were randomly divided into 2 groups （n=30 per group）： the sham operation group and the ischemiareperfusion group（I/R group）。 The rats of I/R group were subjected to 2 h of right middle cerebral artery occlusion （MCAO） with introducing a nylon suture to the right internal carotid artery and then 3， 6， 24， 48 and 72 h of reperfusion， respectively（as 5 subgroups， n=6 in each subgroup）。 The histopathologic changes were observed by HE staining. The apoptotic neurons were detected in CA1 area of hippocampus by TUNEL method. ERK phosphorylation was detected by immunohistochemistry. RESULTS： In I/R group as compared with shamoperation group， after MCAO， the survival neurons in CA1 areas decreased； a lot of apoptotic cells were observed and peaked at 48 h； ERK activity increased 3 h after MCAO and peaked at 6 h and returned to the normal level at 72 h. CONCLUSION： Cerebral ischemiareperfusion may result in the upregulation of ERK activity， and participate in the process of neuron apoptosis.

　　【Keywords 】 brain ischemia； reperfusion； mitogen activated protein kinases； apoptosis； infarction， middle cerebral artery； rats

　　【摘要】 目的： 研究細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）在局灶性腦缺血再灌注海馬神經元中的表達。 方法：線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。 大鼠隨機分成假手術組（sham組）、腦缺血再灌注組（I/R組），每組根據再灌注時間不同再分為3，  6，  24，  48和72 h亞組，每亞組各6只鼠。 在預定時間點進行HE染色觀察組織學變化；TUNEL法檢測CA1區(qū)細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律；免疫組織化學方法研究ERK的表達特征。 結果：MCAO后海馬神經元存活數(shù)量較假手術組明顯減少；凋亡細胞大量出現(xiàn)，以48 h為高峰；MCAO后3 h，磷酸化ERK在局灶性腦缺血大鼠腦組織中顯著升高，6 h達到最高峰，72 h恢復到正常水平。 結論： 腦缺血再灌注損傷可能導致ERK活性上調，參與缺血后神經細胞凋亡過程。

　　【關鍵詞】 腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細胞凋亡；梗塞，大腦中動脈；大鼠

　　0引言

　　近年來人們對腦缺血再灌注損傷進行了廣泛研究，認為細胞信號轉導參與調節(jié)中樞神經系統(tǒng)神經細胞的損傷。 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinases， MAPKs）通過磷酸化轉錄因子而改變基因的表達水平，在細胞信號轉導中起著重要作用，參與細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等生理、病理過程。 MAPKs的3個亞組： ERK， P38和cJun氨基末端激酶（cJunNH2terminal kinase， JNK）。 他們可被許多因子激活，并通過調節(jié)轉錄因子活性而控制基因表達［1］。 研究發(fā)現(xiàn)ERK， p38和JNK在心、腦、肝、腎等組織細胞的缺血/再灌注過程中可被激活［2-3］。 我們選用大鼠大腦中動脈栓塞模型，測定在再灌注后不同時間點，缺血腦海馬CA1區(qū)ERK的活性特征及細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律，試圖闡明ERK在大鼠腦缺血再灌注過程中所起的作用和機制。

　　1材料和方法

　　1.1材料凋亡檢測試劑盒、ERK試劑盒、DAB顯色劑均購于武漢博士德公司。 健康雄性Wistar大鼠60只，體質量200～250 g，由蘭州大學試驗動物中心提供。

　　1.2方法

　　1.2.1實驗動物分組大鼠于術前在22～25℃環(huán)境中飼養(yǎng)1～2 d，術前夜禁食，隨意進水。 隨機分成假手術組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組），根據再灌注時間不同每組再分為3， 6， 24， 48和72 h， 5個亞組，每亞組各6只鼠。

　　1.2.2模型制作根據Nagasawa等［4］的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型。 用水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，將其仰臥固定，分離右側頸總動脈（CCA），頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），結扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA 與ICA分叉下方剪一切口，將一預先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈，插入深度為（18.5±0.5） mm，直到有輕微阻力感為止，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導致腦缺血。 結扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。 2 h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，造模完成。 在缺血2 h和再灌注1 h內，用白熾燈加熱維持大鼠的體溫，體溫維持在肛溫36.5～37.5℃。 假手術組只分離CCA與ECA.動物模型建立成功后按Longa等［5］法對動物的神經功能進行評分，均在2～3分，即以動物清醒后，爬行時向左轉圈（追尾現(xiàn)象），提尾時左前肢內收屈曲。 未達到上述標準者視為模型制作失敗，不計入實驗組。 因麻醉未清醒和經解剖發(fā)現(xiàn)存在有蛛網膜下腔出血者均視為模型制作失敗，不計入實驗組。

　　1.2.3組織切片的制備大鼠再灌注后于3， 6， 24， 48和72 h各時間點，用水合氯醛深度麻醉動物后開胸暴露心臟，經升主動脈插管剪開左心耳，用生理鹽水250 mL快速沖洗，隨后用多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（4℃， pH 7.4）先快后慢灌注約250 mL固定，斷頭取腦后， 在多聚甲醛中固定6～8 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進行石蠟包埋，冠狀面切片，取齒狀回與海馬互包平面的切片，片厚3 μm.

　　1.2.4HE染色、組織學觀察3 μm切片貼片，空氣中干燥，入二甲苯脫脂，乙醇梯度脫水，蘇木素伊紅（HE）染色，二甲苯透明，中性樹脫封片，取24， 48， 72 h組大鼠切片在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內存活神經元數(shù)目。

　　1.2.5免疫組織化學采用免疫組化SABC法進行染色。 切片上滴加1∶200兔抗ERK抗體，4℃孵育過夜，接著用生物素連接的羊抗兔二抗在室溫下反應90 min，再用卵白素生物素復合物室溫下反應90 min，最后用DAB溶液顯色，蘇木素復染細胞核。 貼片，空氣中干燥，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內ERK染色陽性細胞數(shù)。

　　1.2.6原位細胞凋亡檢測取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。 蛋白酶K（20 mg/L）室溫消化，用甲醇配制的過氧化氫消除內源性辣根過氧化物酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉移酶（TdT）與地高辛標記的dUTP混合反應液進行孵育，再加辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細胞，最后脫水透明封片。 在40×10倍Olympus顯微鏡下攝像觀察各組間細胞凋亡變化趨勢。 在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內TUNEL染色陽性細胞數(shù)。

　　統(tǒng)計學處理： 所有數(shù)據以x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，兩組資料不同的時間測量值比較采用重復測量的方差分析，檢驗水準取α＝0.05.

　　2結果

　　2.1HE染色、海馬CA1區(qū)組織學改變假手術組中可見大鼠神經元數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整；缺血組有神經元細胞腫脹，分布不均，細胞周圍間隙增寬，有的細胞體積縮小，核固縮深染（圖1）。 sham組大鼠術后各時間點存活神經元數(shù)目無變化。 I/R組大鼠CA1區(qū)存活神經元數(shù)在I/R后48和72 h顯著少于I/R后24 h（P<0.05）。 與sham組相比較，大鼠I/R后各時間點海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目均明顯減少（表 1）。

　　A： 假手術組；B：缺血再灌注組。

　　圖1海馬CA1區(qū)神經元改變HE ×400（略）

　　表1大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)存留神經元數(shù)目（略）

　　aP<0.05 vs假手術；cP<0.05 vs缺血再灌注24 h.

　　2.2免疫組織化學染色及定量分析ERK染色陽性呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，在細胞核內及胞漿內均有表達。 ERK活性表達于再灌注后3 h明顯增加，陽性細胞胞體較大，并有樹枝狀突起，主要分布于缺血皮層細胞層及皮層下區(qū)域，如海馬分子層、基底節(jié)外層及缺血側胼胝體。 ERK活性于再灌注后6 h達到高峰（圖2），72 h恢復到正常水平。 除72 h I/R組ERK活性表達與sham組比較無顯著差異外（P>0.05），其余I/R組ERK活性表達較sham組均有明顯增加（P<0.01）（表 2）。

　　A： 假手術組；B：缺血再灌注組。

　　圖26 h組免疫組織化學染色海馬CA1區(qū)神經元SABC ×400（略）

　　表2大鼠腦缺血再灌注后不同時間點海馬CA1區(qū)ERK表達陽性神經元數(shù)目（略）

　　P＜0.01 vs假手術。

　　2.3TUNEL法檢測神經細胞凋亡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)，假手術組基本上未見到染色陽性的神經細胞。 缺血再灌注組3 h開始即出現(xiàn)染為黃色的凋亡細胞，隨缺血時間延長，凋亡細胞增多，并有細胞核固縮、凋亡小體等凋亡中晚期形態(tài)特征出現(xiàn)。 凋亡細胞數(shù)于48 h達到高峰（圖3），72 h以后凋亡細胞逐漸減少。 缺血再灌注組與對應各時間點假手術組比較調亡神經元數(shù)目有顯著性差異（P<0.01，表3）。

　　A：假手術組；B：缺血再灌注組。

　　圖348 h組海馬CA1區(qū)凋亡神經元TUNEL ×400（略）

　　表3大鼠腦缺血再灌注不同時間點海馬CA1區(qū)凋亡神經元數(shù)目（略）

　　P<0.01 vs假手術。

　　3討論

　　ERK傳導通路在局灶性腦缺血中發(fā)揮重要作用。 Wu等［2］報道，小鼠MCAO后30 min到2 h ERK水平（用western blotting檢測）在壞死組織中達高峰，在6 h后仍能檢測到。  沙土鼠全腦缺血35 min后再灌注10 min，在CA1區(qū)檢測到ERK增加，但在1 h減少，同時在DG區(qū)可檢測到ERK活性增加［6］。 因此缺血再灌注時ERK活性的增加是細胞針對缺氧刺激啟動修復過程、促進細胞存活的保護性機制，對于經歷了缺血/再灌注損傷的神經元具有保護作用。 本實驗中，腦缺血再灌注3 h后ERK活性顯著增加，于6 h達到高峰，于72 h恢復至對照水平，ERK在神經細胞和膠質細胞中均可見到，表明其發(fā)生主要與磷酸化過程有關，在神經組織中的選擇性沒有很大差異。 缺血/再灌注損傷后組織中ERK活性變化的不一致性可能與實驗用動物種屬，實驗方法及腦缺血/再灌注時間的不同等有關。 就目前的研究結果分析： 缺血/再灌注損傷可使組織細胞的ERK迅速激活，作為早期細胞內信號參與了細胞對這一應激反應的調節(jié)。

　　細胞凋亡是程序性決定基因表達的結果。 在大鼠腦缺血/再灌注模型中凋亡發(fā)生最顯著的部位是缺血周圍區(qū)（缺血半影區(qū)）及缺血敏感區(qū)（如海馬）等部位。 大鼠缺血再灌注24～48 h凋亡的細胞最多。 已有充分的證據說明MAPK途徑在神經元凋亡中起重要作用。 大鼠局灶性腦缺血20 min或2 h后再灌注12～24 h，在IP區(qū)可見到典型的細胞凋亡特征和大量TUNEL陽性細胞，并且凋亡細胞因缺血損傷程度的不同而分布不同［7］。 Fukunaga等［8］用BDNF等刺激培養(yǎng)的海馬神經元的實驗中，證實細胞可通過以RAS/Raf1/MAPK為主的傳導通路激活cfos基因。 使用細胞周期依賴性激酶MAPK的抑制劑可防止神經元因撤除神經營養(yǎng)所致的凋亡。 本實驗中，缺血/再灌注3 h開始凋亡細胞，于48 h達到高峰，72 h以后凋亡細胞有逐漸減少。 可以認為ERK激活的發(fā)生和出現(xiàn)時間較早于凋亡，一方面提示它是凋亡前細胞破壞的酶釋放過程；另一方面，凋亡的發(fā)生可能有ERK的參與，所以較凋亡為早，應用此指標可以預測和檢測凋亡的發(fā)生和程度。

　　局灶性和全腦缺血后，ERK在存活的神經元中活性增加，但在死亡的神經元中活性降低。 本實驗中在腦缺血/再灌注72 h，神經細胞大量死亡，所以ERK活性有所降低，較sham組無大差異。 此結果表明ERK的變化有固定的時間過程，不是一個持續(xù)的過程。 這一結果提示在較早時間內進行有效干預（恢復缺血）可以阻止缺血再灌注后腦損傷的級聯(lián)過程，為臨床治療提供了一個時間窗。

　　對大鼠腦缺血/再灌注損傷后不同部位腦組織ERK表達的測定發(fā)現(xiàn)，對缺血耐受性強的海馬CA3/DG區(qū)ERK活性的增加較對缺血敏感的CA1區(qū)明顯，隨再灌注時間延長，CA3/DG區(qū)ERK活性雖有降低，但是，再灌注24 h時仍高于對照水平，而CA1區(qū)ERK活性隨再灌注時間延長，很快降至對照水平以下。 作者同時檢測了膜蛋白的酪氨酸磷酸化，發(fā)現(xiàn)CA3/DG區(qū)180KD膜蛋白（生長因子受體）的磷酸化再灌注后24 h持續(xù)增加，分析此變化可能為缺血刺激引起的膠質細胞釋放生長因子所致［9］。 ERK部位差別的意義： 皮層下/皮層及多部位均可見到。 這主要與灌注和血流分布有關。 灌注越多的地方發(fā)生ERK改變越多。 提示它的改變是I/R的直接作用結果，其I/R和ERK升高是可能是一個短環(huán)路，即ERK是一個直接的灌注應答指標。

　　總之，ERK傳導通路在局灶性腦缺血后被激活，并在缺血性組織損傷中發(fā)揮重要作用，過量的ERK激活能引起大鼠海馬神經元凋亡發(fā)生，加重腦缺血再灌注損傷。 針對ERK的變化規(guī)律，進行有效干預可望為急性缺血性腦卒中提供一個新的路徑。

　　【參考文獻】

　?。?］ Lennmyr F， Karlsson S， Gerwins P， et al. Activation of mitogenactivated protein kinases in experimental cerebral ischemia［J］。 Acta Neurol Scand， 2002，106（6）：333-340.

　?。?］ Wu DC， Ye W， Che XM， et al. Activation of mitogenactivated protein kinases after permanent cerebral artery occlusion in mouse brain［J］。 J Cereb Blood Flow Metab， 2000，20（9）：1320-1330.

　?。?］ Liu X， Wang S， Wu X， et al. Association between delayed cardioprotection of aged rat myocytes and activation of mitogenactivated protein kinase［J］。 Chin Med J （Engl）， 2000，113（1）：5-9.

　?。?］ Nagasawa H， Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］。 Stroke， 1989，20（8）：1037-1043.

　　［5］ Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery without craniectomy in rats occlusion［J］。 Stroke， 1989，20（1）：84-91.

　?。?］ Namura S， Iihara K， Takami S， et al. Intravenous administration of MEK inhibitor U0126 affords brain protection against forebrain ischemia and focal cerebral ischemia ［J］。 Proc Natl Acad Sci USA， 2001，98（20）：11569-11574.

　　［7］ Lee SH， Kim M， Kim YJ， et al. Ischemic intensity influences the distribution of delayed infarction and apopotic cell death following transient focal cerebral ischemia in rats［J］。 Brain Res， 2002，956（1）：14-23.

　　［8］ Fukunaga K， Miyamoto E. Role of MAP kinase in neurons［J］。 Mol Neurobiol， 1998，16（1）：79-95.

　?。?］ Hu BR， Wieloch T. Tyrosine Phosphorylation and activation of mitogenactivated protein kinase in the rat brain following transient cerebral ischemia ［J］ . J Neurochem， 1994，62（4）：1357-1367.