4.1 電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

　　1809年俄國(guó)物理學(xué)家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象。

　　1909年Michaelis首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱(chēng)為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。

　　1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

　　1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。

　　從本世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。

　　1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開(kāi)創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。30多年來(lái)，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗(yàn)生化物質(zhì)的最高純度：即"電泳純"（一維電泳一條帶或二維電泳一個(gè)點(diǎn)）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱(chēng)為是對(duì)生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即"Last Check".

　　由80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。

　　4.2 電泳的基本原理

　　電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

　　電泳過(guò)程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒(méi)有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對(duì)流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過(guò)程，減少了擴(kuò)散和對(duì)流等干擾作用。最初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用得較少。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來(lái)進(jìn)行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì)，操作簡(jiǎn)單、方便。但對(duì)于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。

　　電泳裝置主要包括兩個(gè)部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類(lèi)。垂直板式電泳是較為常見(jiàn)的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開(kāi)，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm  14 cm，厚度為1mm～2  mm，近年來(lái)新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時(shí)間。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會(huì)引起帶電分子電荷的改變，進(jìn)而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過(guò)程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。

　　為了更好的了解帶電分子在電泳過(guò)程中是如何被分離的，下面簡(jiǎn)單介紹一下電泳的基本原理。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓（V），就會(huì)在電極中間產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度（E），L是電極間距離。

　　在稀溶液中，電場(chǎng)對(duì)帶電分子的作用力（F），等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積。

　　這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中，分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（F‘）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比，對(duì)于球狀分子，F(xiàn)’的大小服從Stokes定律，即：醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)

　　F‘=6πrηυ

　　式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度（υ= d / t，單位時(shí)間粒子運(yùn)動(dòng)的距離，cm / s ）。當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)時(shí)： F = F‘，

　　∴  qoE = 6πrηυ

　　由此可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。

　　用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR.

　　帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過(guò)程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開(kāi)。即使兩個(gè)分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過(guò)程中就可以被分離。有些類(lèi)型的電泳幾乎完全依賴(lài)于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳；而有些類(lèi)型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過(guò)程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過(guò)各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標(biāo)記，則可以通過(guò)放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測(cè)。

　　4.3 影晌電泳分離的主要因素

　　由電泳遷移率的公式可以看出，影響電泳分離的因素很多，下面簡(jiǎn)單討論一些主要的影響因素：

　　1. 待分離生物大分子的性質(zhì)

　　待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳有明顯影響。一般來(lái)說(shuō)，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。

　　2. 緩沖液的性質(zhì)

　　緩沖液的pH值會(huì)影響待分離生物大分子的解離程度，從而對(duì)其帶電性質(zhì)產(chǎn)生影響，溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會(huì)影響到其電泳方向，當(dāng)緩沖液pH大于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過(guò)程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩(wěn)定性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度，一般在0.02－0.2，離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，但如果離子強(qiáng)度過(guò)高，會(huì)在待分離分子周?chē)纬奢^強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），由于離子氛與待分離分子的移動(dòng)方向相反，它們之間產(chǎn)生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會(huì)對(duì)電泳速度產(chǎn)生影響。

　　3. 電場(chǎng)強(qiáng)度

　　電場(chǎng)強(qiáng)度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱(chēng)電位梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳速度越快。但增大電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)引起通過(guò)介質(zhì)的電流強(qiáng)度增大，而造成電泳過(guò)程產(chǎn)生的熱量增大。電流在介質(zhì)中所做的功（W）為：

　　W=I2.R.t

　　上式中：I為電流強(qiáng)度，R為電阻，t為電泳時(shí)間。

　　電流所作的功絕大部分都轉(zhuǎn)換為熱，因而引起介質(zhì)溫度升高，這會(huì)造成很多影響：

　?、贅悠泛途彌_離子擴(kuò)散速度增加，引起樣品分離帶的加寬；②產(chǎn)生對(duì)流，引起待分離物的混合；③如果樣品對(duì)熱敏感，會(huì)引起蛋白變性；④引起介質(zhì)粘度降低、電阻下降等等。電泳中產(chǎn)生的熱通常是由中心向外周散發(fā)的，所以介質(zhì)中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質(zhì)相對(duì)于外周部分粘度下降，摩擦系數(shù)減小，電泳遷移速度增大，由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強(qiáng)度，可以減小生熱，但會(huì)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，引起待分離生物大分子擴(kuò)散的增加而影響分離效果。所以電泳實(shí)驗(yàn)中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)強(qiáng)度，同時(shí)可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。

　　4. 電滲

　　液體在電場(chǎng)中，對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)，稱(chēng)為電滲現(xiàn)象。由于支持介質(zhì)表面可能會(huì)存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面通常有一些羧基，瓊脂可能會(huì)含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基團(tuán)等等。這些基團(tuán)電離后會(huì)使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場(chǎng)的作用下向電極方向移動(dòng)，形成介質(zhì)表面溶液的流動(dòng)，這種現(xiàn)象就是電滲。在pH值高于3時(shí)，玻璃表面帶負(fù)電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場(chǎng)的作用下，向負(fù)極遷移，帶動(dòng)電極液產(chǎn)生向負(fù)極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同，則加快電泳速度；如果相反，則降低電泳速度。

　　5. 支持介質(zhì)的篩孔

　　支持介質(zhì)的篩孔大小對(duì)待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動(dòng)速度快，反之，則泳動(dòng)速度慢。

　　4.4 電泳的分類(lèi)

　?、?區(qū)帶電泳：電泳過(guò)程中，待分離的各組分分子在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的電泳技術(shù)。

　?、?自由界面電泳： 這是瑞典Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在U形管中進(jìn)行電泳，無(wú)支持介質(zhì)，因而分離效果差，現(xiàn)已被其他電泳技術(shù)所取代。

　?、?等速電泳：需使用專(zhuān)用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運(yùn)動(dòng)。

　　⑷ 等電聚焦電泳：由兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。

　　按支持介質(zhì)的不同可分為：

　　⑴ 紙電泳（Paper electrophorisis）

　　⑵ 醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis）

　　⑶ 瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis）

　　⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）

　　⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。

　　按支持介質(zhì)形狀不同可它為：

　?、?薄層電泳 ；   ⑵ 板電泳 ；   ⑶ 柱電泳。

　　按用途不同可分為：

　　⑴ 分析電泳；  ⑵ 制備電泳；  ⑶ 定量免疫電泳； ⑷ 連續(xù)制備電泳。

　　按所用電壓不同可分為：

　　⑴ 低壓電泳：100V～500V，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。

　　⑵ 高壓電泳：1000V～5000V，電泳時(shí)間短，有時(shí)只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類(lèi)等小分子物質(zhì)的分離。

　　4.5 紙電泳和醋酸纖維薄膜電泳

　　紙電泳是用濾紙作支持介質(zhì)的一種早期電泳技術(shù)。盡管分辨率比凝膠介質(zhì)要差，但由于其操作簡(jiǎn)單，所以仍有很多應(yīng)用，特別是在血清樣品的臨床檢測(cè)和病毒分析等方面有重要用途。

　　紙電泳使用水平電泳槽。分離氨基酸和核苷酸時(shí)常用pH 2～3.5的酸性緩沖液，分離蛋白質(zhì)時(shí)常用堿性緩沖液。選用的濾紙必須厚度均勻，常用國(guó)產(chǎn)新華濾紙和進(jìn)口的Whatman l.點(diǎn)樣方法有干點(diǎn)法和濕點(diǎn)法。濕點(diǎn)法是在點(diǎn)樣前即將濾紙用緩沖液浸濕，樣品液要求較濃，不亦多次點(diǎn)樣。干點(diǎn)法是在點(diǎn)樣后再用緩沖液和噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)吹干后多次點(diǎn)樣，因而可以用較稀的樣品。電泳時(shí)要選擇好正、負(fù)極，電壓通常使用2～10 l～10 g和5 g～100 1號(hào)濾紙。點(diǎn)樣位置是在濾紙的一端距紙邊5cm～10cm處。樣品可點(diǎn)成園形或長(zhǎng)條形，長(zhǎng)條形的分離效果較好。點(diǎn)樣量為5 V/cm的低壓電泳，電泳時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于氨基酸和肽類(lèi)等小分子物質(zhì)，則要使用50～200 V/cm的高壓電泳，電泳時(shí)間可以大大縮短，但必須解決電泳時(shí)的冷卻問(wèn)題，并要注意安全。

　　電泳完畢記下濾紙的有效使用長(zhǎng)度，然后烘干，用顯色劑顯色，顯色劑和顯色方法，可查閱有關(guān)書(shū)藉。定量測(cè)定的方法有洗脫法和光密度法。洗脫法是將確定的樣品區(qū)帶剪下，用適當(dāng)?shù)南疵搫┫疵摵筮M(jìn)行比色或分光光度測(cè)定。光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計(jì)直接定量測(cè)定各樣品電泳區(qū)帶的含量。

　　醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相似，只是換用了醋酸纖維薄膜作為支持介質(zhì)。將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨ィ苡诒笸坎汲捎芯患?xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm.

　　醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相比有以下優(yōu)點(diǎn)：① 醋酸纖維薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)"拖尾"現(xiàn)象，染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶更清晰。② 快速省時(shí)。由于醋酸纖維薄膜親水性比濾紙小，吸水少，電滲作用小，電泳時(shí)大部分電流由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，完成全部電泳操作只需90 min左右。③ l 血清，點(diǎn)樣量甚至少到0. 靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需 2 g的蛋白樣品也可以得到清晰的電泳區(qū)帶。臨床醫(yī)學(xué)用于檢測(cè)微量異常蛋白的改變。④ l，僅含5 1 應(yīng)用面廣?？捎糜谀切┘堧娪静灰追蛛x的樣品，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等。⑤ 醋酸纖維薄膜電泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度計(jì)和分光光度計(jì)掃描定量及長(zhǎng)期保存。

　　由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單、快速、價(jià)廉，目前已廣泛用于分析檢測(cè)血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。

　　4.6 瓊脂糖凝膠電泳

　　瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，主要是由D－半乳糖和3，6脫水L－半乳糖連接而成的一種線(xiàn)性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對(duì)流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒(méi)有電荷，但一些糖基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過(guò)程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。市售的瓊脂糖有不同的提純等級(jí)，主要以硫酸根的含量為指標(biāo)，硫酸根的含量越少，提純等級(jí)越高。

　　瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來(lái)進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對(duì)于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無(wú)關(guān)。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖（62 C時(shí)熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。 C）可以在65  ~ 65

　　由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對(duì)較少。

　　4.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱(chēng)為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2（NHCOHC=CH2） 2 N，N‘-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過(guò)硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基。

　　聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過(guò)改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來(lái)控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對(duì)蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。

　　選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是：

　　C = 6.5－0.3T

　　此式可用于計(jì)算T為5％～20％時(shí)的凝膠組成。C值并不很?chē)?yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1％，當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑最小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大，C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中最常用的C是2.6％和3％。

　　配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個(gè)月，在貯存期間丙烯酰胺會(huì)水解為丙烯酸而增加電泳時(shí)的電內(nèi)滲現(xiàn)象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時(shí)要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無(wú)毒。

　　未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過(guò)程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類(lèi)和含量。

　　由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點(diǎn)，因而四十年來(lái)得到廣泛的應(yīng)用，目前尚無(wú)更好的支持介質(zhì)能夠取代它。其主要的優(yōu)點(diǎn)有：①可以隨意控制膠濃度"T"和交聯(lián)度"C"，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L.③由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，沒(méi)有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生"電滲".④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。⑤透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無(wú)紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長(zhǎng)的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。

　　聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)最初是在玻璃管中進(jìn)行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長(zhǎng)10 cm，將凝膠裝入到多個(gè)管中進(jìn)行電泳，又稱(chēng)為柱狀電泳。目前仍有應(yīng)用，尤其用于二維電泳中的第一維電泳。但由于各個(gè)玻璃管的不同以及裝膠時(shí)的差異使每管的分離條件會(huì)有所差異，所以對(duì)各管樣品進(jìn)行比較時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)較大誤差。后來(lái)發(fā)展起來(lái)的垂直平板電泳一次最多可以容納20個(gè)樣品，電泳過(guò)程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進(jìn)行更好的比較，重復(fù)性也更好，所以垂直平板電泳目前應(yīng)用的更為廣泛，常用于蛋白質(zhì)及DNA序列分析過(guò)程中DNA片段的分離、鑒定。

　　水平平板電泳近年來(lái)也有很快的發(fā)展，與垂直平板電泳相比也有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常只要1小時(shí)左右，而園盤(pán)電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時(shí)。③因?yàn)榭梢允褂帽∧z，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可長(zhǎng)期保存不會(huì)龜裂。④便于適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發(fā)展起來(lái)的只有水平電泳系統(tǒng)才能使用的新的半干技術(shù)，即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液，大大節(jié)約了試劑，簡(jiǎn)化了操作，提高了電泳速度。

　　聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強(qiáng)度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個(gè)重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個(gè)單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。

　　4.8 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

　　SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。

　　SDS－PAGE -巰基乙醇的樣品處理液，SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-（CH2）10-CH2OSO3- 是在要走電泳的樣品中加入含有SDS和 -巰基乙醇可以斷開(kāi)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮3～5 Na+），是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑 min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子，這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，用于控制電泳過(guò)程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

　　制備凝膠時(shí)首先要根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x膠濃度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍是104～105，即分子量小于104的蛋白質(zhì)可以不受孔徑的阻礙而通過(guò)凝膠，而分子量大于105的蛋白質(zhì)則難以通過(guò)凝膠孔徑，這兩種情況的蛋白質(zhì)都不能得到分離。所以如果要分離較大的蛋白質(zhì)，需要使用低濃度如10％或7.5%的凝膠（孔徑較大）；而對(duì)于分離較小的蛋白質(zhì)，使用的較高濃度凝膠（孔徑較小）可以得到更好的分離效果。分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠（約1 cm），并在濃縮上插入樣品梳，形成上樣凹槽。濃縮膠是低濃度的聚丙烯酰胺凝膠，由于濃縮膠具有較大的孔徑（丙烯酰胺濃度通常為3～5％），各種蛋白質(zhì)都可以不受凝膠孔徑阻礙而自由通過(guò)。濃縮膠通常pH值較低（通常pH = 6.8），用于樣品進(jìn)入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后即可通電開(kāi)始電泳。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)中最典型、國(guó)內(nèi)外均廣泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH堿性不連續(xù)系統(tǒng)，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為4％，pH = 6.8，分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5％，pH = 8.8.電極緩沖液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS和HCl配制。

　　樣品在電泳過(guò)程中首先通過(guò)濃縮膠，在進(jìn)入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，Cl－、甘氨酸陰離子以及蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，在濃縮膠的pH值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而Cl－的電泳遷移率最大。在電場(chǎng)的作用下，Cl－最初的遷移速度最快，這樣在Cl－后面形成低離子濃度區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)，而低電導(dǎo)區(qū)會(huì)產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，因此Cl－后面的離子在較高的電場(chǎng)強(qiáng)度作用下會(huì)加速移動(dòng)。達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，Cl－和甘氨酸之間形成穩(wěn)定移動(dòng)的界面。而蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物由于相對(duì)量較少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被濃縮成很窄的區(qū)帶（可以被濃縮三百倍），所以在濃縮膠中Cl－是快離子（前導(dǎo)離子），甘氨酸是慢離子（尾隨離子）。

　　當(dāng)甘氨酸到達(dá)分離膠后，由于分離膠的pH值（通常pH = 8.8）較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過(guò)蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超過(guò)蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物。這時(shí)蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進(jìn)行電泳，向正極移動(dòng)。由于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在單位長(zhǎng)度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，進(jìn)入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過(guò)凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過(guò)凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當(dāng)?shù)娜旧褐校ㄈ缤ǔＪ褂玫目捡R斯亮藍(lán)）染色幾個(gè)小時(shí)，而后過(guò)夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結(jié)合的背底染料，這時(shí)就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質(zhì)區(qū)帶。通常凝膠制備需要1～1.5小時(shí)，電泳在25～30mA下通常需要3小時(shí)，染色2～3小時(shí)，過(guò)夜脫色。通常使用的垂直平板電泳可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的電泳。

　　Ornstein和Davis設(shè)計(jì)的高pH堿性不連續(xù)系統(tǒng)，有其獨(dú)特的特點(diǎn)：① 濃縮膠的pH（6.8）小于慢離子甘氨酸的pKa（9.8）3個(gè)pH左右，所以 α≈ 0.001，即在濃縮膠中甘氨酸只有0.1％離解，因此在電場(chǎng)中遷移很慢，是慢離子。② 快離子Cl－由于幾乎全部離解，電泳遷移率最大，不受pH變化的影響。③ 分離膠的pH（8.8）小于慢離子的pKa 一個(gè)pH左右，α≈ 0.1，所以在分離膠中甘氨酸離解加大，電泳遷移率加大，就趕到蛋白質(zhì)帶的前面。

　　此外還可以總結(jié)出該系統(tǒng)的特點(diǎn)有：④ 電極緩沖液中共軛堿Tris的pKa小于分離膠的pH約1個(gè)pH，使其緩沖能力大。⑤電極緩沖液的pH為8.3，相近于Tris的pKa（8.1），以便獲得最大的緩沖能力。

　　SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測(cè)定，在同一凝膠上對(duì)一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白及未知蛋白進(jìn)行電泳，測(cè)定各個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳距離（或遷移率），并對(duì)各自分子量的對(duì)數(shù)（log Mr）作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定未知蛋白質(zhì)的電泳距離（或遷移率），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)就可以求出未知蛋白的分子量。

　　SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過(guò)程中純度的檢測(cè)，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級(jí)的蛋白質(zhì)，而且通過(guò)電泳還可以同時(shí)得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對(duì)于了解未知蛋白及設(shè)計(jì)提純過(guò)程都是非常重要的。

　　4.9 梯度凝膠電泳

　　梯度凝膠電泳也通常采用聚丙烯酰胺凝膠，但不是在單一濃度（孔徑）的凝膠上進(jìn)行，而是形成梯度凝膠。從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為5％，底部凝膠濃度為25％。凝膠梯度是通過(guò)梯度混合器形成的，高濃度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液濃度呈梯度下降，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小。梯度凝膠電泳也通常加入SDS，并有濃縮膠。電泳過(guò)程與SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳基本類(lèi)似。與單一濃度的凝膠相比，梯度凝膠有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①首先，梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時(shí)分離較大范圍分子量的蛋白質(zhì)。單一凝膠電泳對(duì)于分子量超過(guò)其分離范圍的蛋白質(zhì)，過(guò)大或過(guò)小，都不能分離。而梯度凝膠孔徑范圍比單一凝膠大，分子量較大的蛋白質(zhì)可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質(zhì)可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質(zhì)可以同時(shí)得到分離。例如用4％～30％的梯度膠可以分離分子量5萬(wàn)～200萬(wàn)的蛋白質(zhì)。② 另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質(zhì)。電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在梯度凝膠中遷移，經(jīng)過(guò)的孔徑越來(lái)越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)就被濃縮，集中在一個(gè)很窄的區(qū)帶中。而分子量略小的蛋白質(zhì)可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區(qū)帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變小，在蛋白質(zhì)不能通透的孔徑附近對(duì)蛋白有濃縮作用，所以電泳后形成很窄的區(qū)帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質(zhì)。對(duì)于太稀的樣品，在電泳過(guò)程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質(zhì)分子最終都會(huì)滯留在其相應(yīng)的凝膠孔徑中而得到分離。③ 可以直接測(cè)定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測(cè)定分子量的方法互為補(bǔ)充。

　　梯度凝膠電泳主要適用于測(cè)定球蛋白的分子量，而對(duì)纖維蛋白將產(chǎn)生較大的誤差。由于分子量的測(cè)定必須是在未知和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子到達(dá)完全被阻止遷移的孔徑時(shí)才能成立，因此電泳時(shí)要使用較高的電壓，例如平板凝膠為0.5mm厚，使用600V電壓， 50mA電流，電泳時(shí)間約需2小時(shí)。

　　4.10 等電聚焦

　　等電聚焦電泳是根據(jù)兩性物質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的不同而進(jìn)行分離的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等電點(diǎn)相差0.01的蛋白質(zhì)，是分離兩性物質(zhì)如蛋白質(zhì)的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過(guò)加入兩性電解質(zhì)形成一個(gè)pH梯度，兩性物質(zhì)在電泳過(guò)程中會(huì)被集中在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域內(nèi)，從而得到分離。

　　兩性電解質(zhì)是人工合成的一種復(fù)雜的多氨基－多羧基的混合物。不同的兩性電解質(zhì)有不同的pH梯度范圍，既有較寬的范圍如pH＝3～10，也有各種較窄的范圍如pH＝7～8.要根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當(dāng)?shù)膬尚噪娊赓|(zhì)，使待分離樣品中各個(gè)組分都在兩性電解質(zhì)的pH范圍內(nèi)，兩性電解質(zhì)的pH范圍越小，分辨率越高。

　　等電聚焦多采用水平平板電泳，也使用管式電泳。由于兩性電解質(zhì)的價(jià)格昂貴，使用1～2 mm厚的凝膠進(jìn)行等電聚焦價(jià)格較高。使用兩條很薄的膠帶做為玻璃板間隔，可以形成厚度僅0.15 mm的薄層凝膠，大大降低成本，所以等電聚焦通常使用這種薄層凝膠。由于等電聚焦過(guò)程需要蛋白質(zhì)根據(jù)其電荷性質(zhì)在電場(chǎng)中自由遷移，通常使用較低濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如4％）以防止分子篩作用，也經(jīng)常使用瓊脂糖，尤其是對(duì)于分子量很大的蛋白質(zhì)。制作等電聚焦薄層凝膠時(shí)，首先將兩性電解質(zhì)、核黃素與丙烯酰胺貯液混合，加入到帶有間隔膠條的玻璃板上，而后在上面加上另一塊玻璃板，形成平板薄層凝膠。經(jīng)過(guò)光照聚合后，將一塊玻璃板橇開(kāi)移去，將一小薄片濕濾紙分別置于凝膠兩側(cè)，連接凝膠和電極液（陽(yáng)極為酸性如磷酸溶液，陰極為堿性如氫氧化鈉溶液）。接通電源，兩性電解質(zhì)中不同的等電點(diǎn)的物質(zhì)通過(guò)電泳在凝膠中形成pH梯度，從陽(yáng)極側(cè)到陰極側(cè)pH值由低到高呈線(xiàn)性梯度分布。而后關(guān)閉電源，上樣時(shí)取一小塊濾紙吸附樣品后放置在凝膠上，通電30 min后樣品通過(guò)電泳離開(kāi)濾紙加入凝膠中，這時(shí)可以去掉濾紙。最初樣品中蛋白質(zhì)所帶的電荷取決于放置樣品處凝膠的pH值，等電點(diǎn)在pH值以上的蛋白質(zhì)帶正電，在電場(chǎng)的作用下向陰極移動(dòng)，在遷移過(guò)程中，蛋白質(zhì)所處的凝膠的pH值逐漸升高，蛋白質(zhì)所帶的正電逐漸減少，到達(dá)pH＝pI處的凝膠區(qū)域時(shí)蛋白質(zhì)不帶電荷，停止遷移。同樣，等電點(diǎn)在上樣處凝膠pH以下的蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向陽(yáng)極移動(dòng)，最終到達(dá)pH＝pI處的凝膠區(qū)域停止?？梢?jiàn)等電聚焦過(guò)程無(wú)論樣品加在凝膠上什么位置，各種蛋白質(zhì)都能向著其等電點(diǎn)處移動(dòng)，并最終到達(dá)其等電點(diǎn)處，對(duì)最后的電泳結(jié)果沒(méi)有影響。所以有時(shí)樣品可以在制膠前直接加入到凝膠溶液中。使用較高的電壓（如2000V，0.5mm平板凝膠）可以得到較快速的分離（0.5～1小時(shí)），但應(yīng)注意對(duì)凝膠的冷卻以及使用恒定功率的電源。凝膠結(jié)束后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色時(shí)應(yīng)注意，由于兩性電解質(zhì)也會(huì)被染色，使整個(gè)凝膠都被染色。所以等電聚焦的凝膠不能直接染色，要首先經(jīng)過(guò)10％的三氯乙酸的浸泡以除去兩性電解質(zhì)后才能進(jìn)行染色。

　　等電聚焦還可以用于測(cè)定某個(gè)未知蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，將一系列已知等電點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（通常pI在3.5～10之間）及待測(cè)蛋白同時(shí)進(jìn)行等電聚焦。測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳區(qū)帶到凝膠某一側(cè)邊緣的距離對(duì)各自的pI值作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。而后測(cè)定待測(cè)蛋白的距離，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可求出其等電點(diǎn)。

　　等電聚焦具有很高的靈敏度，特別適合于研究蛋白質(zhì)微觀不均一性，例如一種蛋白質(zhì)在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一帶，而在等電聚焦中表現(xiàn)三條帶。這可能是由于蛋白質(zhì)存在單磷酸化、雙磷酸化和三磷酸化形式。由于幾個(gè)磷酸基團(tuán)不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的分子量產(chǎn)生明顯的影響，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一帶，但由于它們所帶的電荷有差異，所以在等電聚焦中可以被分離檢測(cè)到。同功酶之間可能只有一兩個(gè)氨基酸的差別，利用等電聚焦也可以得到較好的分離效果。由于等電聚焦過(guò)程中蛋白質(zhì)通常是處于天然狀態(tài)的，所以可以通過(guò)前面介紹的活性染色的方法對(duì)酶進(jìn)行檢測(cè)。等電聚焦主要用于分離分析，但也可以用于純化制備。雖然成本較高，但操作簡(jiǎn)單、純化效率很高。除了通常的方法，制備性等電聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或顆粒狀凝膠如Sephadex G-75中進(jìn)行。

　　4.11 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D―PAGE）

　　二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離）以及SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離）。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。通常第一維電泳是等電聚焦，在細(xì)管中（φ1～3 mm）中加入含有兩性電解質(zhì)、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。將處理過(guò)的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過(guò)程中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進(jìn)入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個(gè)蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細(xì)胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個(gè)蛋白質(zhì)，有些報(bào)道可以分辨出5000～10000個(gè)斑點(diǎn)，這與細(xì)胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細(xì)胞提取液中檢測(cè)某個(gè)蛋白。例如將某個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)入到青蛙的卵母細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入細(xì)胞的提取液的二維電泳圖譜的比較，轉(zhuǎn)入mRNA的細(xì)胞提取液的二維電泳圖譜中應(yīng)存在一個(gè)特殊的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，這樣就可以直接檢測(cè)mRNA的翻譯結(jié)果。二維電泳是一項(xiàng)很需要技術(shù)并且很辛苦的工作。目前已有一些計(jì)算機(jī)控制的系統(tǒng)可以直接記錄并比較復(fù)雜的二維電泳圖譜。

　　4.12 蛋白質(zhì)的檢測(cè)、鑒定及回收

　　檢測(cè)蛋白質(zhì)最常用的染色劑是考馬斯亮藍(lán)R－250（CBB，Coomassie brilliant blue），通常是用甲醇：水：冰醋酸（體積比為45：45：10）配制0.1％或0.25％（W/V）的考馬斯亮藍(lán)溶液作為染色液。這種酸－甲醇溶液使蛋白質(zhì)變性，固定在凝膠中，防止蛋白質(zhì)在染色過(guò)程中在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，通常染色需2小時(shí)。脫色液是同樣的酸－甲醇混合物，但不含染色劑，脫色通常需過(guò)夜搖晃進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)染色具有很高的靈敏度，在聚丙烯酰胺凝膠中可以檢測(cè)到0.1 g的蛋白質(zhì)形成的染色帶?？捡R斯亮藍(lán)與某些紙介質(zhì)結(jié)合非常緊密，所以不能用于染色濾紙、醋酸纖維素薄膜以及蛋白質(zhì)印跡（在硝化纖維素紙上）。在這種情況下通常是用10％的三氯乙酸浸泡使蛋白質(zhì)變性，而后使用不對(duì)介質(zhì)有強(qiáng)烈染色的染料如溴酚藍(lán)、氨基黑等對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。

　　銀染是比考馬斯亮藍(lán)染色更靈敏的一種方法，它是通過(guò)銀離子（Ag+）在蛋白質(zhì)上被還原成金屬銀形成黑色來(lái)指示蛋白區(qū)帶的。銀染可以直接進(jìn)行也可以在考馬斯亮藍(lán)染色后進(jìn)行，這樣凝膠主要的蛋白帶可以通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色分辨，而細(xì)小的考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)不到的蛋白帶由銀染檢測(cè)。銀染的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色高100倍，可以檢測(cè)低于1 ng的蛋白質(zhì)。

　　糖蛋白通常使用過(guò)碘酸－Schiff試劑（PAS）染色，但PAS染色不十分靈敏，染色后通常形成較淺的紅－粉紅帶，難以在凝膠中觀察。目前更靈敏的方法是將凝膠印跡后（下面介紹）用凝集素檢測(cè)糖蛋白。凝集素是從植物中提取的一類(lèi)糖蛋白，它們能識(shí)別并選擇性的結(jié)合特殊的糖，不同的凝集素可以結(jié)合不同的糖。將凝膠印跡用凝集素處理，再用連接辣根過(guò)氧化物酶的抗凝集素抗體處理，然后再加入過(guò)氧化物酶的底物，通過(guò)生成有顏色的產(chǎn)物就可以檢測(cè)到凝集素結(jié)合情況。這樣凝膠印跡用不同的凝集素檢測(cè)不僅可以確定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。

　　通過(guò)掃描光密度儀對(duì)染色的凝膠進(jìn)行掃描可以進(jìn)行定量分析，確定樣品中不同蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。掃描儀測(cè)定凝膠上不同遷移距離的吸光度值，各個(gè)染色的蛋白帶形成對(duì)應(yīng)的峰，峰面積的大小可以代表蛋白質(zhì)的含量的多少。另外一種簡(jiǎn)單的方法是將染色的蛋白帶切下來(lái)，在一定體積的50％吡啶溶液中搖晃過(guò)夜溶解染料，而后通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值就可以估算蛋白質(zhì)的含量。但應(yīng)注意，蛋白質(zhì)只有在一定的濃度范圍內(nèi)其含量才與吸光度值成線(xiàn)性關(guān)系，另外不同的蛋白質(zhì)即使在含量相同的情況下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定只能是一種半定量的結(jié)果。

　　盡管凝膠電泳通常是作為一種分析工具使用，它也可以用于蛋白質(zhì)的純化制備。但電泳后需將蛋白質(zhì)從凝膠中回收，通常是將所需的蛋白質(zhì)區(qū)帶部分的凝膠切下，通過(guò)電泳的方法將蛋白質(zhì)從凝膠中洗脫下來(lái)（稱(chēng)為電洗脫）。目前有各種商品電洗脫池裝置。最簡(jiǎn)單的方法是將切下的凝膠裝入透析袋內(nèi)加入緩沖液浸泡，再將透析袋浸入緩沖液中進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)就會(huì)向某個(gè)電極方向遷移而離開(kāi)凝膠進(jìn)入透析袋內(nèi)的緩沖液。由于蛋白質(zhì)不能通過(guò)透析袋，所以電泳后蛋白質(zhì)就留在透析袋的緩沖液中。電洗脫后可通一個(gè)反向電流，持續(xù)幾秒鐘，使吸附在透析袋上的蛋白質(zhì)進(jìn)入緩沖液，這樣就可以將凝膠中的蛋白質(zhì)回收。

　　4.13 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）

　　印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱(chēng)為Southern印跡法。而后人們用類(lèi)似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱(chēng)為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Eastern印跡法。

　　蛋白質(zhì)印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片硝酸纖維素膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會(huì)通過(guò)毛細(xì)作用流過(guò)凝膠。緩沖液通過(guò)凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜可以與蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。這個(gè)過(guò)程持續(xù)過(guò)夜，就可以將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。但這種方法轉(zhuǎn)移的效率較低，通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中一小部分蛋白質(zhì)（10％～20％）。電泳印跡可以更快速有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。這種方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成"三明治"形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開(kāi)凝膠結(jié)合在硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱(chēng)為一個(gè)印跡（blot），用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。印跡首先用蛋白溶液（如10％的BSA）處理以封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，這樣清洗去除未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。處理過(guò)的印跡進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗是抗鼠Ig G的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。目前有結(jié)合各種標(biāo)記物的抗特定Ig G的抗體可以直接購(gòu)買(mǎi)作為標(biāo)記的二抗。最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶純化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)的位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無(wú)色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過(guò)氧化物酶可以以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過(guò)氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000倍，通過(guò)將印跡放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的存在。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，主要包括以下一些：

　　I125標(biāo)記的二抗可以通過(guò)放射性自顯影檢測(cè)。

　　熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗可以通過(guò)在紫外燈下產(chǎn)生熒光來(lái)檢測(cè)。

　　I125標(biāo)記金黃色葡萄球菌蛋白A（Protein A）：Protein A可以與Ig G的Fc區(qū)特異性的結(jié)合，因此Protein A可以代替二抗：I125標(biāo)記的Protein A通過(guò)放射性自顯影檢測(cè)。

　　金標(biāo)記的二抗：二抗通過(guò)微小的金顆粒包裹，與一抗結(jié)合時(shí)可以表現(xiàn)紅色。

　　生物素結(jié)合的二抗：印跡用生物素結(jié)合的二抗處理后，再用堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結(jié)合，這種方法實(shí)際上相當(dāng)于通過(guò)生物素與凝集素的緊密結(jié)合將二抗與酶連接，通過(guò)酶的顯色反應(yīng)就可以進(jìn)行檢測(cè)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是由于生物素是一個(gè)小分子蛋白，一個(gè)抗體上可以結(jié)合多個(gè)生物素，也就可以結(jié)合多個(gè)酶連接的凝集素，可以大大增強(qiáng)顯色反應(yīng)的信號(hào)。

　　除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)特定蛋白的探針以外，有時(shí)也使用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測(cè)印跡中的DNA結(jié)合蛋白。

　　4.14 毛細(xì)管電泳

　　毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis， CE）又叫高效毛細(xì)管電泳（HPCE）， 是近年來(lái)發(fā)展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75 內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離， 創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。1987年Hjerten 建立了毛細(xì)管等電聚焦， Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988～1989年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器。短短幾年內(nèi)， 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽、蛋白質(zhì)（包括酶，抗體）、核苷酸乃至脫氧核糖核酸（DNA）的分離分析要求， 得到了迅速的發(fā)展。CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE和高效液相色譜法（HPLC）相比， 其相同處在于都是高效分離技術(shù)， 儀器操作均可自動(dòng)化， 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間， CE的分析時(shí)間通常不超過(guò)30min， 比HPLC速度快；對(duì)CE而言， 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比， 對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言， 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級(jí)， 最低可達(dá)270fl， 流動(dòng)相用量也只需幾毫升， 而HPLC所需樣品為μl級(jí)， 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備， 而HPLC可作常量制備。CE和普通電泳相比， 由于其采用高電場(chǎng)， 因此分離速度要快得多；檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外， 其它類(lèi)型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè)；一般電泳定量精度差，而CE和HPLC相近；CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多。總之， CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少：高靈敏度， 常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率， 其每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)；高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn)， 而HPLC一般為幾千到幾萬(wàn)；高速度， 最快可在60s內(nèi)完成， 在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì)， 1.7min分離19種陽(yáng)離子， 3min內(nèi)分離30種陰離子； 樣品少， 只需nl （10-9 L）級(jí)的進(jìn)樣量；成本低， 只需少量（幾毫升）流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力， 使CE成為近年來(lái)發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。當(dāng)然CE還是一種正在發(fā)展中的技術(shù)， 有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開(kāi)發(fā)。

　　"CE"統(tǒng)指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力， 以毛細(xì)管為分離通道， 依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類(lèi)液相分離技術(shù)。其儀器結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源， 一根毛細(xì)管， 一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中， 帶電粒子在電場(chǎng)作用下， 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。CE所用的石英毛細(xì)管柱， 在pH>3情況下， 其內(nèi)表面帶負(fù)電， 和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下， 雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲， 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流（EOF）兩種速度的矢量和， 正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致， 故最先流出；中性粒子的電泳流速度為"零"，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反， 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度， 故它將在中性粒子之后流出， 從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。