【關(guān)鍵詞】  血管瘤，海綿狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)；皰疹病毒4型，人；B淋巴細胞；細胞系

　　Establishment of immortal lymphoblastoid cell lines in a pedigree of cerebral cavernous malformations

　　LI Min， WANG LiBin， WANG YuJiong， MA AiYing， L ShuTao

　　Key Labortory of Biotechnology， Ningxia University，  Central Laboratory， Affiliated Hospital， Ningxia Medical College， Yinchuan 750021， China

　　【Abstract】 AIM： To establish immortal lymphoblastoid cell lines in a pedigree of cerebral cavernous malformations（CCM）。 METHODS： The cell lines were constructed by means of adding EpsteinBarr virus and Cyclosporine A onto peripheral B lymphocytes. RESULTS： We successfully established 7 immortal lymphoblastoid cell lines in the family， and 5 of them suffered from CCM. CONCLUSION： These immortal lymphoblastoid cell lines would preserve the unique genome of CCM.

　　【Keywords】 hemangioma， cavernous， central nevvous system； herpesvirus 4， human； B lymphocytes； Cell line

　　【摘要】 目的： 建立腦海綿狀血管瘤家系永生細胞株。 方法： 利用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細胞，同時加入環(huán)孢霉素A的方法。 結(jié)果： 成功建立了該疾病家系7名成員永生細胞株，其中5名為患者。 結(jié)論： 腦海綿狀血管瘤家系永生細胞株成功建立。

　　【關(guān)鍵詞】 血管瘤，海綿狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)；皰疹病毒4型，人；B淋巴細胞；細胞系

　　0引言

　　腦海綿狀血管瘤（cerebral cavernous malformation， CCM）是一種常見的腦血管先天性發(fā)育異常疾病，在臨床上可分為家族性遺傳和散發(fā)性遺傳兩大類。 該病發(fā)病率高，病因復雜，對人危害很大，是醫(yī)學和分子遺傳學研究領(lǐng)域的熱點之一［1］。 利用EB病毒（EpsteinBarr virus， EBV）轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細胞，使其成為能連續(xù)分裂永久生存的類淋巴母細胞（lymphoblastoid），以進一步建立各種疾患者群的永生細胞株（immortalized cell lines），可永久保存每種疾病個體的完整基因組，且基因組的生化和分子生物學特性不會發(fā)生變化，因而是進行細胞遺傳學和分子遺傳學研究極好的材料。 我們以EBV加環(huán)孢霉素A （cyclosporine A，CyA）的轉(zhuǎn)化技術(shù)，對采自內(nèi)蒙古左旗地區(qū)一個遺傳性CCM家系外周血淋巴細胞進行了轉(zhuǎn)化，成功建立了該家系7名成員（5名為患者）的永生細胞株，從而為永久保存該疾病遺傳資源以及今后進一步研究該病的發(fā)病機制提供了可靠的實驗材料。

　　1材料和方法

　　1.1材料RPMI1640（Gibco），  Hepes（Gibco）用去離子水配成1 mol/L的溶液，胎牛血清（FCS， Hyclone，美國），淋巴細胞分離液（天津），環(huán)孢霉素A（Cyclosporine A， CyA，瑞士）用RPMI1640液稀釋成0.2  g/L的儲存液，植物細胞凝集素（phaseolus vulgaris， PHA， Gibco）用去離子水配成0.2  g/L的溶液，二甲基亞砜（Sigma），青、鏈霉素（雙抗，寧夏啟元藥業(yè)）用去離子水配成10g/L的溶液，L谷氨酰胺（Sigma）用去離子水配成0.2 mol/L的溶液，非洲狨猴Ｂ958細胞株（購自中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所），37℃ CO2培養(yǎng)箱（Shellba，美國）等。 全培養(yǎng)液按照每1L含762 mL RPMI1640， 200 mL胎牛血清，16 mL Hepes， 12 mL L谷氨酰胺，以及10 mL雙抗的比例配制；凍存液按950 mL/L胎牛血清和50 mL/L二甲基亞砜的比例配制，4℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　EBV液來自B958細胞株，提取時先復蘇并培養(yǎng)B958細胞，當細胞處于指數(shù)生長期時，收集全部細胞懸液，反復凍融3次，再轉(zhuǎn)移至離心管中，3000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 μm濾膜過濾后分裝，-80℃保存。

　　血液樣本7份，均來自內(nèi)蒙古左旗地區(qū)一個CCM遺傳病家系，家系背景清楚。 其中5人經(jīng)核磁共振檢查確診為腦海綿狀血管瘤患者。 在征得患者及其家屬知情同意的情況下，無菌采集其新鮮外周血4 mL至含0.5 mL肝素的抗凝試管中，輕搖防止血液凝固，室溫靜置24 h（CCM家系見圖1）。 本實驗所采集7份樣本分別為Ⅱ1， Ⅱ3， Ⅱ5， Ⅱ7， Ⅲ2， Ⅲ3， Ⅲ4等；其中Ⅱ1， Ⅱ3， Ⅱ5， Ⅱ7， Ⅲ3為該疾病確診患者。

　　圖1遺傳性腦海綿狀血管瘤家系圖（略）

　　1.2方法將RPMI1640液2 mL加入到所采集的抗凝血液中，充分混勻，然后將其緩慢地沿管壁移入預裝有4 mL已預熱（37℃）淋巴細胞分離液的離心管中，室溫3000 r/min離心25 min. 用吸管小心吸取中間的淋巴細胞層，將其移入另一支15 mL離心管中，并加入不完全培養(yǎng)基10 mL，將淋巴細胞團吹散，使其在液體中均勻分布。 繼而依次2500， 2000 r/min和1500 r/min分別離心15 min，并于每次離心后棄上清，再以不完全培養(yǎng)液10 mL吹散淋巴細胞。 每份全血分離出的細胞用2 mL完全培養(yǎng)液重懸，然后依次加入EBV 1.2 mL， CyA 0.4 mL和PHA 30 μL，輕輕搖勻。 將細胞懸液等份轉(zhuǎn)入2個25 cm2一次性培養(yǎng)瓶中，置37℃，含50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，觀察細胞轉(zhuǎn)化情況，根據(jù)細胞轉(zhuǎn)化和聚集情況進行加液或半量換液，當細胞數(shù)達到3～6×109/L時即可對其進行凍存。 利用本實驗室人員建立的染色體G顯帶技術(shù)條件，比較轉(zhuǎn)化后B淋巴細胞與來自同一個體的新鮮外周血淋巴細胞的染色體的G帶，從而判斷轉(zhuǎn)化后的B淋巴細胞的染色體是否發(fā)生變異。

　　2結(jié)果

　　2.1轉(zhuǎn)化結(jié)果按照EBV加CyA的方法對7份血液樣本進行轉(zhuǎn)化，于轉(zhuǎn)化后第10天觀察細胞轉(zhuǎn)化情況：在顯微鏡下可看到散在的成團細胞（圖2A），該細胞透明發(fā)亮，體積明顯增大，外壁有不規(guī)則的毛刺狀突起，即為淋巴母細胞樣B細胞；同時可以看到一些皺縮退化的細胞，此為被CyA抑制死亡的T 淋巴細胞。 約3 wk后，轉(zhuǎn)化細胞明顯增多，顯微鏡下可看到大量的永生細胞團（圖2B），表明轉(zhuǎn)化成功。

　　A： 轉(zhuǎn)化初期的B淋巴細胞（×200）；B： 轉(zhuǎn)化成功×200.

　　圖2轉(zhuǎn)化細胞形態(tài)（略）

　　2.2轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定采用我室建立的永生細胞染色體G顯帶技術(shù)條件和常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)，比較永生B淋巴細胞與來自同一個體新鮮外周血中淋巴細胞的染色體的G帶（圖3A，B），未發(fā)現(xiàn)有任何變異，表明轉(zhuǎn)化后的B淋巴細胞保留了正常的染色體核型，未發(fā)生畸變。

　　A： 外周血淋巴細胞的染色體G顯帶（×100）；B轉(zhuǎn)化后（×100）。

　　圖3染色體核型分析結(jié)果（略）

　　2.3細胞株穩(wěn)定性的驗證當已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功的細胞培養(yǎng)至密度達到3×109/L以上時，即可對其進行凍存，并分別于凍存后1/3 mo， 1 mo和6 mo后進行了復蘇、培養(yǎng)和鑒定，該細胞株依然保持旺盛的增殖特性，且染色體核型未發(fā)生變異，表明建株成功，即成功獲得了CCM遺傳家系的永生細胞株。

　　3討論

　　以EBV加CyA感染并轉(zhuǎn)化人外周血淋巴細胞的方法所建立的永生細胞株具有永久生存和增殖的特性，而且該細胞株還可以穩(wěn)定保持供血者原有細胞核型及各種遺傳信息和遺傳特性，并且凍存后的細胞可以隨時復蘇以作相關(guān)研究［2］。 因此，利用該技術(shù)建立疾病細胞株可避免因患者死亡或其他原因造成的實驗材料丟失以及反復采血所帶來的不便，從而為廣泛、深入研究疾病的病因、發(fā)病機制及防治等提供永久的實驗材料［3］。 EBV主要是通過結(jié)合B淋巴細胞表面上的EBV受體（補體受體）CR2而感染B淋巴細胞。 被感染B細胞在EBV核抗原EBNA的刺激下轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞樣細胞，其端粒酶活性提高，維護了細胞染色體端粒長度的穩(wěn)定，并能夠不斷分裂增殖，從而促使B淋巴細胞的永生性生長［4］。 對EBV基因組序列及其表達的研究主要是用B958株進行的，B958細胞株是用從患傳染性單核細胞增多癥患者B細胞內(nèi)提取的EBV感染非洲絨猴B淋巴細胞建立的［5］。 我們培養(yǎng)購自中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所的B958細胞株并提取EBV進行轉(zhuǎn)化，得到了具有高效價的EBV，轉(zhuǎn)化一次成功率達到100%.

　　由于絕大部分人都曾受到過EBV的感染，人體內(nèi)會產(chǎn)生出對EBV的免疫反應，尤其是細胞免疫反應。 血清中抗EBV陽性個體的淋巴細胞中含有對EBV特異的記憶T細胞。 當用EBV感染B細胞的同時，EBV特異的記憶T細胞也被激活，這導致對EBV轉(zhuǎn)化的自體B細胞產(chǎn)生特異的細胞毒作用［6］。 為了避免這種現(xiàn)象的產(chǎn)生，我們采用具有明顯選擇性抑制T細胞的CyA. CyA是一種由11個氨基酸組成的高脂溶性多肽，它是一種新型的強效免疫抑制劑，在EBV轉(zhuǎn)化中可以有效地阻抑T細胞對B細胞的細胞毒性作用，防止轉(zhuǎn)化B細胞的退化，從而保證B細胞的增殖［7］。通常在細胞株的建立時，每4 mL全血分離的淋巴細胞中，CyA的終濃度以2 mg/L為宜。 CyA加入的時間以在EBV感染后24 h內(nèi)效果較好，若在72 h后再加入則由于T淋巴細胞已經(jīng)增殖生長，使得CyA不能起到明顯的抑制作用［8］。 PHA是從豆科植物種子中提取的凝集素，該凝集素能夠刺激淋巴細胞幼稚化和分裂增殖。 為了提高EBV轉(zhuǎn)化效率，在EBV感染之前常用PHA處理淋巴細胞，它能起到輔助細胞增殖的作用，從而可以明顯提高B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率［9］。 本研究中，我們采用轉(zhuǎn)化同時加入CyA和PHA的辦法，達到了滿意的轉(zhuǎn)化結(jié)果，全部標本均一次轉(zhuǎn)化成功。 為今后進一步研究CCM的遺傳機理提供了寶貴的實驗材料。

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