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整體動物心肌細(xì)胞的增殖能力在出生后僅能維持一個短時(shí)期,小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌細(xì)胞的增殖能力就明顯降低至成年鼠水平。小鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng),一般選用生后1-10d的乳鼠心臟,尤以出生1-4d的較好,此時(shí)心肌細(xì)胞已分化充分,適于作各種研究,而出生4d以后的乳鼠心臟中分離出來的心肌細(xì)胞較慢發(fā)育成為有自律性搏動的心肌細(xì)胞。
?、妗試劑]
1、培養(yǎng)液:1:1 混合的DMEM / F12 培養(yǎng)液,添加終濃度為10%小牛血清(FCS)、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 鏈霉素。
2、消化液:胰酶(效價(jià)為1:250) 0.08%、膠原酶II(活力為150U/mg) 0.05% ,用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制,-20 ℃保存。
3、 D-Hanks溶液(pH 7.2-7.8):KCl 0.4 g , KH2PO4 0.06 g , NaCl 8.00g , NaHCO3 0.35 g , Na 2HPO4?7H2O 0.09 g , 酚紅 0.01 g 1L
?、?、[實(shí)驗(yàn)步驟]
1、取生后1-4d的乳鼠,用75%乙醇消毒皮膚,再用大頭針固定乳鼠的頭及四肢,剪開胸部皮膚,用75%乙醇消毒皮下組織,更換鑷子及剪刀,開胸取出心臟,將心臟放入盛有D-Hanks溶液的平皿(或青霉素瓶)中,剪去心房,剪開心室,用D-Hanks溶液沖洗三次,去除殘留積血后,將心臟剪成1mm3 大小的碎片,再將心臟碎片轉(zhuǎn)移至離心管中,加5ml左右消化液,37℃消化5 min,自然沉淀,棄上清,再加5ml左右消化液,37℃消化20min(每隔2min振搖幾下),用吸管吹打1min 后,將未消化完全的心臟碎片吸出至另一離心管中,加入2ml冷的培養(yǎng)液終止消化,1000 rpm 5min ,棄上清,沉淀中加入D-Hanks溶液2ml, 1500 rpm 10min ,棄上清,沉淀中加入培養(yǎng)液2ml,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液。(為節(jié)約時(shí)間,以下步驟省略)上述未消化完全的心臟碎片補(bǔ)加5ml左右消化液后繼續(xù)消化,同樣操作,合并細(xì)胞懸液后放入培養(yǎng)瓶中置二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃ 5%CO2)培養(yǎng)。
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