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一、設(shè)備: 無菌操作設(shè)備。
二、大型設(shè)備CO2培養(yǎng)箱:恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。
倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細胞生長情況。
解剖顯微鏡,用于準確地取材。
常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養(yǎng)液,解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱:-20℃——80℃,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。
電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋:用于消毒培養(yǎng)皿,手術(shù)器械。
過濾器:配制解剖液、培養(yǎng)液,必須過濾后才可使用,以去除細菌。
滲透壓儀,pH劑,天平等。
三、培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械
1 培養(yǎng)皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。
2 培養(yǎng)板,24-40孔,可用于開放培養(yǎng)。
3 培養(yǎng)瓶:
4 吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5 各類培養(yǎng)液貯存器。
6 小型手術(shù)器械。
準備:
一 配制培養(yǎng)液
?。?) 解剖液:以無機鹽(去除Ca2+, Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。
(2) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。
?。?) 接種培養(yǎng)液:用于胰酶消化后的細胞分散,做成細胞懸液,其成分為MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當天配制。
?。?) 維持培養(yǎng)液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2.其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。
二 培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠
三消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d,達兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養(yǎng)前1天進行。
神經(jīng)細胞分散培養(yǎng)
(一) 選材 常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚,則黑質(zhì)以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng),常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經(jīng)成活率高。
?。ǘ?取材。腦則取出相應(yīng)組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側(cè),分別培養(yǎng)。
?。ㄈ?細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細胞懸液,計數(shù),預(yù)置細胞密度,接種于培養(yǎng)皿(1×106),做電生理應(yīng)為5×105或更低。
(四) 抑制膠質(zhì)細胞生長。培養(yǎng)3-5d后,也有人認為培養(yǎng)7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長。
?。ㄎ澹?觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現(xiàn)象,細胞生長突起明顯,5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯,7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞下面,形成地毯,2周時神經(jīng)細胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經(jīng)細胞開始退化,變形,甚至出現(xiàn)空泡,一般培養(yǎng)2-4周最宜。
但神經(jīng)細胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而且隨培養(yǎng)時間的延長,細胞數(shù)量在下降,但膠質(zhì)細胞可以,神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以。在培養(yǎng)過程中,早期9-12d時,有較多的神經(jīng)細胞死亡,這是第一次死亡階段,應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多,且相互形成突觸。
(六) 常用培養(yǎng)細胞實驗有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;
但免疫組化分析應(yīng)注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核內(nèi)抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
在免疫組化中,或其它組織學染色中,常用不同的染色方法以區(qū)分不同細胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質(zhì)細胞標記明顯;GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應(yīng)用價值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視,其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷)、退行性疾?。ㄈ鏏D、PD)、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞功能和營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。
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