【摘要】  目的：探討不同劑量的辛伐他汀處理裸鼠體內(nèi)K562細胞的信號通路的分子變化，以說明辛伐他汀誘導K562細胞凋亡的分子機制。 方法：體外培養(yǎng)K562細胞并經(jīng)皮下接種Balb/cnu/nu裸小鼠K562細胞，構建裸小鼠的K562細胞動物模型。 采用缺口末端標記技術TUNEL法檢測辛伐他汀誘導K562細胞早期凋亡的變化。 采用RTPCR檢測K562細胞中Ras分子和PI3KAKT信號通路的nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達。 結果： 不同劑量的辛伐他汀能夠誘導裸鼠體內(nèi)K562細胞凋亡，并隨劑量的增加凋亡率逐漸增高（P<0.01）；不同劑量的辛伐他汀能夠引起nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的表達差異（P<0.01）。 結論： 辛伐他汀能夠引起參與K562細胞凋亡的Ras 分子和PI3KAKT信號通路的基因變化，從一定的角度說明辛伐他汀在體內(nèi)能夠誘導K562細胞凋亡。

　　【關鍵詞】  辛伐他汀；K562細胞；裸鼠；凋亡

　　0引言

　　慢性粒細胞白血病（CML）融合基因bcr/abl編碼產(chǎn)物P210bcr/abl可激活Ras， PI3K， STATs等多條信號途徑。 辛伐他汀對慢性粒細胞白血病細胞的作用機制多限于體外研究，有必要觀察和探討其在實驗動物體內(nèi)的效果和作用機理。 而且，p21ras和PI3K的上游激活可啟動BcrAbl誘導的轉化，其下游靶標仍未完全清楚［1］。 我們用辛伐他汀作用裸鼠體內(nèi)K562細胞，檢測它對裸鼠體內(nèi)K562細胞的影響，以說明辛伐他汀是否通過引起裸鼠體內(nèi)K562細胞中Ras分子和Ras下游的PI3KAKT信號通路的分子水平的變化來誘導K562細胞凋亡的發(fā)生。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　12只健康裸鼠，雌性，4+周齡，購自四川大學華西醫(yī)學中心，并飼養(yǎng)于SPF標準的實驗室。 辛伐他汀購自中國藥品生物制品檢定所，以無水乙醇溶解后，再加入與辛伐他汀等摩爾的NaOH，50℃水浴2 h，調(diào)整pH值至7.20，過濾除菌，調(diào)節(jié)濃度至0.2 g/L備用。 噻唑藍、二甲亞砜購自Sigma公司，培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，TUNEL試劑盒為美國Roche公司產(chǎn)品。 Trizol 和逆轉錄試劑Rever TraAce購自Bioflux公司，擴增的基因引物由英駿生物技術有限公司合成，PCR試劑由北京天為時代科技有限公司提供。

　　1.2方法

　　1.2.1細胞培養(yǎng)

　　K562細胞購自四川大學華西醫(yī)學中心，以含100 mL/L滅活小牛血清，100萬U/L青霉素，80萬U/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃， 5 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　1.2.2慢性粒細胞白血病動物模型的構建

　　取對數(shù)生長期的K562細胞用PBS洗滌2次，調(diào)整至5×1010/L，于裸鼠右前腋下皮下注射0.4 mL，待接種K562細胞的3只裸鼠身上的腫瘤組織長到2 cm3左右時，處死裸鼠。 取腫瘤組織均勻地分成體積相當?shù)男K組織進行另外12只裸鼠的皮下移植。 待皮下移植的腫瘤組織長到0.5 cm3左右時，將12只裸鼠隨機分成3組，對照組4只，腹腔注射生理鹽水0.2 mL，處理組分成2個劑量組，各4只，T1組注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 mL，T2組注射0.2 g/L的辛伐他汀0.4 mL. 對照組和處理組隔日分別注射生理鹽水和辛伐他汀，連續(xù)6次。

　　1.2.3原位末端轉移酶標記法（TUNEL）

　　檢測腫瘤組織細胞早期凋亡按原位凋亡基因檢測試劑盒說明書的步驟進行操作，檢測細胞凋亡。 同時設立陰性對照和陽性對照，陰性對照不加Tunel混合液，陽性對照加DNase.

　　1.2.4RTPCR檢測

　　RTPCR檢測nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達。 取質(zhì)量相等的腫瘤組織進行冰上勻漿，按照總RNA提取試劑說明書， 加入1 mL Trizol提取總RNA，紫外分光光儀定量。 RNA逆轉錄合成cDNA，逆轉錄體系40 μL，其中總RNA 2 μg， 42℃水浴50 min，然后進行PCR擴增。 各基因的正義和反義引物序列分別是nras： F 5′>3′ TACATCGAGACCTCGGCCAA， R 3′>5′ CGTTCACACACGAGAGGACT，產(chǎn)物150 bp； pi3k： F 5′>3′ AACTCTGGGGATGACCTGGA，R 3′>5′ AGGCGGTCACA ACACTCCTA，產(chǎn)物300 bp； akt1 F 5′>3′ AGGGTTGGCTGCACAAACGA， R 3′>5′  GTTGTTGA AGAGACACCGCG，產(chǎn)物150 bp； nfκb1： F 5′>3′ TGAAGTGAT CCAGGCAGCCT，R 3′>5′ CACCTCTGTAGGAAGGCGTT，產(chǎn)物150 bp. pi3k， akt1， nfκb1的內(nèi)參GAPDH1：    5′>3′ACCACAGTCCATGCCATCAC， 3′>5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA；產(chǎn)物450 bp；nras的內(nèi)參GAPDH2：5′>3′GGCCTCCAAGGAGTAAGACC，3′>5′ AGGGGTCTACAT GGCAACTG，產(chǎn)物147 bp.

　　PCR反應體系為：總體積25 μL， cDNA 3 μL，上下游引物各1 μL， 2×master mix 12.5 μL，用ddH2O補足至25 μL. 擴增條件為：94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 59℃ 1 min， 72℃ 1 min， 30個循環(huán)；72℃ 10 min， 4℃ 30 min. 取10 μL目的基因擴增產(chǎn)物和4 μL GAPDH擴增產(chǎn)物進行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

　　統(tǒng)計學處理：用Quantity One軟件分析基因的表達，組間均數(shù)比較采用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析以及LSDt檢驗。

　　2結果

　　2.1辛伐他汀能誘導腫瘤組織細胞凋亡

　　凋亡細胞判斷及評價標準：根據(jù)凋亡細胞呈散在分布，細胞核被染成紅色形態(tài)符合凋亡特征，用Image pro Plus5.0分析免疫組化結果，結果采用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析。 對照組的凋亡指數(shù)為0.20±0.01，T1組的凋亡指數(shù)為0.50±0.02，T2組的凋亡指數(shù)為0.71±0.04， 三組比較有統(tǒng)計學差異（P=0.001， 圖1）。

　　2.2辛伐他汀能夠誘導CML腫瘤組織細胞nras， pi3k， akt1， nfκb1 mRNA的差異表達各基因的RTPCR結果有一定差異（圖2）。

　　隨著辛伐他汀劑量的加大，K562細胞中nras mRNA明顯表達下調(diào)，對照組與處理組之間的nras mRNA差異表達有統(tǒng)計學意義（P≈0.000），處理組本身之間的nras mRNA差異表達也有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。 pi3k mRNA在對照組與處理組之間表達差異有統(tǒng)計學意義（P≈0.000），pi3k mRNA在對照組與T1， T2組的差異表達分別都具有統(tǒng)計學意義（P≈0.000）。 處理組本身之間pi3k mRNA的差異表達有統(tǒng)計學意義（P≈0.000）。 akt1 mRNA在對照組與處理組之間也有統(tǒng)計學意義（P≈0.000），對照組與T1，T2組的差異表達分別都具有統(tǒng)計學意義（P≈0.000），處理組本身之間akt1 mRNA的差異表達有統(tǒng)計學意義（P≈0.000）。 對照組與處理組之間的nfκb1 mRNA的差異表達有統(tǒng)計學意義（P≈0.000），對照組與T1，T2組nfκb1 mRNA的差異表達分別都具有統(tǒng)計學意義（P≈0.000）。

　　3討論

　　慢性粒細胞白血病細胞中的Ras癌基因編碼的21 kd的G蛋白在信號通路轉導、增殖、分化和惡性轉移中有重要作用［2-3］。 Ras蛋白要發(fā)生異戊二烯化等翻譯后修飾才能與細胞膜結合和具有完整的生物學活性。 MAPK/ERK通路上的包括Ras在內(nèi)的癌基因和抑癌基因在20％～30％的人類腫瘤中可發(fā)現(xiàn)經(jīng)常性的基因突變。 基于人類腫瘤Ras突變的頻繁性比其他基因高，開發(fā)MAPK/ERK抑制劑這類抗腫瘤藥物是頗具希望的藥理學策略。 其中一個策略就是體內(nèi)阻斷癌基因Ras的功能，來抑制Ras的轉錄后的翻譯后修飾［3］。 我們研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀注射裸鼠后能引起CML組織的K562細胞nras mRNA的表達差異，nras mRNA隨辛伐他汀劑量加大明顯下調(diào)。研究表明K562細胞BcrAbl能夠依賴PI3K激活下游分子的方式模擬IL3刺激細胞增殖［4］。 此外，AKT還可直接作用于凋亡信號如Bad和轉錄因子forkhead家族或間接調(diào)控P53和NFκB對細胞凋亡進行調(diào)節(jié)。 因此，AKT是腫瘤治療的一個重要靶點。 而我們的研究表明，辛伐他汀在體內(nèi)作用CML組織的K562細胞后能夠誘pi3k和akt1 mRNA的表達上調(diào)，同時抑制PI3K/AKT通路下游的nfκb1的表達。

　　PI3K/AKT通路作為一條與細胞增殖密切相關的信號途徑可受Ras癌蛋白和IL3等多種因素的激活，本實驗中pi3k和akt1 mRNA水平的表達上調(diào)可能受到K562細胞中的BcrAbl融和蛋白的激活而被誘導表達上調(diào)。 轉錄因子NFκB是MEK/MAPK通路下游的一個靶標，雖然NFκB的激活與許多凋亡活動的發(fā)生有關［5］，但它能阻斷許多刺激引起的凋亡效應，包括化療藥物。 NFκB的抗凋亡效應來自其對凋亡抑制劑的誘導。 NFκB是細胞信號傳導通路中的重要環(huán)節(jié)，也是預防癌癥以及增強化療敏感性的一個理想的治療靶位點［6］。 我們的研究表明，辛伐他汀能夠引起NFκB通路nfκb1的表達下調(diào)，說明辛伐他汀在體內(nèi)可能通過引起NFκB通路中的nfκb1的表達下調(diào)參與CML組織K562細胞凋亡的發(fā)生。

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