【摘要】  目的 研究灌服中藥扶正解毒湯（FJD）后兔血清對硫酸鎳（NiSO4）暴露的人支氣管上皮細胞（16HBE）自由基含量及8羥基2脫氧鳥苷三磷酸酶（8oxodGTPase）表達的影響。方法 體外培養(yǎng)的16HBE細胞分別經NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒湯含藥血清共同處理后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）及實時熒光定量RTPCR檢測自由基含量及8oxodGTPase表達的變化。結果 NiSO4（800μmol/L）暴露的16HBE細胞，其自由基含量及8oxodGTPase表達水平均高于NiSO4與扶正解毒湯（10%）共處理組細胞，Ｐ＜005～001，相對標準偏差（RSD）＞2%.結論 8oxodGTPase可作為鎳暴露氧化應激的標記物；中藥扶正解毒湯通過清除自由基，下調8oxodGTPase的表達，對鎳暴露氧化損傷具有顯著的抑制作用。

　　【關鍵詞】  扶正解毒湯

　　本課題組多年進行的體內實驗及職業(yè)病臨床研究表明，中藥扶正解毒湯（FJD）具有良好地拮抗鎳毒性的作用〔1，2〕。本文從體外途徑研究了中藥解毒湯對硫酸鎳（NiSO4）暴露的人支氣管上皮（16HBE）細胞內自由基含量及8羥基2脫氧鳥苷三磷酸酶（8oxodGTPase）表達的影響，旨在為該復方的作用機制補充新的資料。

　　1  材料與方法

　　11  材料

　　111  細胞及動物16HBE細胞（美國ATCC公司）。純種青紫蘭兔8只，雄性，體重（21±03）kg（中國蘭州生物制品研究所），合格證號：14004，常規(guī)飼養(yǎng)。

　　112  中藥  扶正解毒湯由紅芪、當歸、丹參、枸杞等組成，以三蒸水煎煮，過濾、濃縮成含生藥4g/ml的溶液，高溫高壓消毒滅菌，密封，4℃以下儲存?zhèn)溆谩?/P>

　　113  主要試劑及設備  基礎培養(yǎng)液（MEM）培養(yǎng)基、Trizol試劑盒（美國GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；乙酰乙酸鹽2，7二氯氫化熒光素（D399）（美國Molecular Probes公司）；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）；TCS sp2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；Smart Cycler ⅡSystem熒光定量PCR儀（美國PE公司）。人類human NutT homologue （hMTH1）基因PCR引物設計參照文獻〔３〕。分別為P1：5′CTTCTCTGCGCCACTCAA3′，P2：5′GAGCGGCGGTGCAGAACC3′；預計擴增片段177bp.βactin引物為P1：5′TTGCGCTCAGGAGCAAT3′，P2：5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3′；預計擴增片段223bp（寶生物工程有限公司合成）。

　　12  方法

　　121  扶正解毒湯血清凍干粉制備  以中藥扶正解毒湯12g/kg每天分2次給兔等體積灌胃，空白對照組予以生理鹽水（灌胃前均禁食，自由取水），共3d.于末次灌胃后2h心臟采血，按文獻〔4〕方法制備扶正解毒湯血清及空白血清凍干粉。

　　122  細胞培養(yǎng)及受試物處理  16HBE細胞用含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO２飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。試驗時以不含小牛血清的MEM培養(yǎng)液將細胞調至1×104/ml，按以下分組分別處理：（1）NiSO4組：NiSO4以無血清MEM培養(yǎng)液溶解，終濃度800μmol/L（預試驗中，NiSO4≥800μmol/L時，細胞存活率驟降至60%以下，故以800μmol/L作為此試驗濃度）。（2）扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒湯血清，終濃度為10%（體積分數），再加入NiSO4（800μmol/L）。（3）扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組：同時加入扶正解毒湯與NiSO4.（4）空白血清對照（簡稱空白血清）+NiSO4組：同時加入空白血清與NiSO4.終濃度均同（2）。（5）空白血清組：加入空白血清（10%）。（6）陰性對照組：MEM培養(yǎng)液。

　　123  細胞存活率檢測  以常規(guī)臺盼藍計數法檢測各組細胞存活率，每組共計數250個細胞。

　　124  細胞內自由基含量檢測  在加入NiSO416h后，將收集的各組細胞制成細胞懸液，取D399（5μg/ml）1ml，加至各細胞懸液中，按文獻〔5〕方法以激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測16HBE細胞內自由基含量（以平均熒光強度表示）。

　　125  RNA提取、cDNA合成及標準定量模板的制備  在進行自由基含量測定的同時，另收集各組細胞，按Trizol試劑盒說明，提取各組總RNA，測定A260，A280的吸光度值，計算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作說明逆轉錄合成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆?。將寶生物工程有限公司構建的hMTH1及βactin定量PCR標準品質粒利用各自的引物進行RT-PCR擴增，制備6個不同濃度的標準模板，分別定義為101～106拷貝數/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　126  SYBR GreenⅠ實時定量PCR反應  根據SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明，設定反應擴增條件，將6組實驗樣品與不同濃度的標準模板同時進行PCR.重復3次。將檢測的臨界點設定在擴增過程中，熒光信號由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環(huán)數（threshold cycle，CT）作為模板初始濃度的間接指標，將不同濃度的標準模板拷貝的對數相應的CT值作圖，得到標準曲線。

　　127  8oxodGTPase（hMTH1 mRNA）表達的相對定量分析  將得到的各組hMTH1基因及βactin基因的值分別代入各自的標準曲線，換算出各自的起始模板量。以βactin作為參比基因對所有樣品進行RNA校正，用hMTH1基因的定量結果除以βactin定量結果即可得到校正值。以陰性對照組hMTH1 mRNA的表達量作為“1”，再根據校正值計算出其他各組的相對量，進行組間相對量的比較。

　　13  統(tǒng)計分析  采用SPSS 100統(tǒng)計軟件進行分析；組間差異用t檢驗及相對標準偏差（RSD）檢驗（以RSD＞2%為差異有統(tǒng)計學意義）。

　　2  結果

　　21  細胞存活率  經臺盼藍計數，各組的細胞存活數均不低于90%，且差異無統(tǒng)計學意義。

　　22  LSCM檢測結果（表1，圖1A～Ｃ）  NiSO4染毒后16h，細胞D399平均熒光強度（自由基含量）明顯增強，扶正解毒湯血清與NiSO4共處理各組D399平均熒光強度顯著低于NiSO4組（Ｐ＜005～001）；空白血清對染鎳細胞內自由基含量變化無影響。

　　表1  扶正解毒湯血清對染鎳16HBE內自由基含量變化的影響（略）

　　注：與陰性對照組比較，a Ｐ＜005；與NiSO4組比較，b Ｐ＜005，c Ｐ＜001

　　A：NiSO4組  B：扶正解毒湯+NiSO4（Ⅰ）組   C：扶正解毒湯+NiSO4（Ⅱ）組

　　圖1  LSCM下16HBE細胞內D399熒光強度（×40）（略）

　　23  實時定量PCR反應的標準曲線分析  hMTH1和βactin定量標準曲線的斜率分別為-10388和-11021，r2分別為09990和09966.表明線性關系良好，在實驗濃度范圍內能夠進行準確定量。

　　24  扶正解毒湯血清對染鎳細胞８oxodGTPase（hMTH1 mRNA）表達的影響（表2）  與陰性對照組比較，NiSO4染毒組細胞８oxodGTPase表達明顯增強（RSD=58%），且空白血清對此結果無影響；而扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組、扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組細胞８oxodGTPase表達水平則明顯低于NiSO4組（RSD分別為67%，63%）。

　　3  討論

　?。釜瞣xodGTPase由hMTH1基因編碼，可催化DNA氧化損傷產物8羥基2脫氧鳥苷三磷酸（８oxodGTP）的水解，從而阻止后者向DNA的錯誤摻入，減少突變。故被視為一種內源性抗氧化、抗突變酶〔6〕，又可作為一種氧化應激的標記物〔3〕。鎳化合物可通過誘導氧化應激等途徑產生一系列細胞遺傳毒性，甚至癌變〔7，8〕。本研究發(fā)現，NiSO4（800μmol/L）暴露16HBE細胞16h，其自由基含量及８oxodGTPase表達均明顯增強，間接證實了鎳暴露16HBE細胞內氧化應激的存在，同時也證明了８oxodGTPase作為氧化應激標記物的作用。16HBE細胞經扶正解毒湯血清與NiSO4共同處理后，其自由基明顯降低，而８oxodGTPase的表達水平則無明顯增加。提示扶正解毒湯可能通過預防或直接清除方式而減少染鎳細胞內自由基的產生，發(fā)揮體外抗氧化作用，此與體內實驗結果一致〔９，１０〕。同時亦可認為，扶正解毒湯與NiSO4共處理組細胞內８oxodGTPase表達的下調，并非扶正解毒湯血清直接作用的結果，而正是由于扶正解毒湯對ROS迅速而有效的清除，使得該氧化應激標記物的“預警”效應處于低或不應答狀態(tài)，從而反證了扶正解毒湯的抗氧化作用。有關扶正解毒湯抗鎳暴露氧化損傷的具體機制還需進一步探討。

　　表2  不同處理組細胞hMTH1 mRNA表達的相對量比較（略）

　　注：與陰性對照組比較，a RSD=58%；與NiSO4組比較，b RSD=67%，c RSD＝63%

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