血液細胞染色總結(jié)

血涂片在用光學顯微鏡觀察前需要固定和染色。固定是將細胞蛋白質(zhì)和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持細胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。染色是使細胞的主要結(jié)構(gòu)，如細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識別。血涂片染色方法大多源自羅氏染色法，常用瑞氏染色法、吉姆薩染色法。

（一）瑞氏染色法

1.瑞氏染料由酸性染料伊紅（E-）和堿性染料亞甲藍（M＋）組成。伊紅通常為鈉鹽，有色部分為陰離子。亞甲藍（又稱美藍）為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍，有色部分為陽離子。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料（即天青）。將適量伊紅、美藍溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美藍和伊紅；二是固定細胞形態(tài)。

2.染色原理：既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用。各種細胞成分化學性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。如血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細胞核蛋白、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞胞質(zhì)為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染紫藍色或藍色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫紅色，稱為嗜中性物質(zhì)；原始紅細胞、早幼紅細胞胞質(zhì)、核仁含較多酸性物質(zhì)，染成較濃厚的藍色；中幼紅細胞既含酸性物質(zhì)，又含堿性物質(zhì)，染成紅藍色或灰紅色；完全成熟紅細胞，酸性物質(zhì)徹底消失后，染成粉紅色。

3.pH值的影響：細胞各種成分均屬蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，紅細胞和嗜酸性粒細胞染色偏紅，細胞核呈淡藍色或不染色；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍結(jié)合，所有細胞呈灰藍色，顆粒呈深暗，嗜酸性顆粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性顆粒偏粗，呈紫黑色。稀釋染液必須用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致細胞染色反應呈色異常，形態(tài)難以識別，甚至錯誤。

4.試劑配制

（1）Ⅰ液：瑞氏染料1.0g、純甲醇（AR級以上）600ml、甘油15ml。將染料放入清潔干燥乳缽中，先加少量甲醇慢慢研磨（至少30min），以使染料充分溶解，然后將溶解的染料倒入潔凈的棕色瓶內(nèi)，乳缽內(nèi)再加入少許甲醇細研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止，最后加15ml甘油，密閉保存。

（2）Ⅱ液：磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8），由磷酸二氫鉀（KH2P04）0.3g、磷酸氫二鈉（Na2HP04）0.2g、蒸餾水加至1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口貯存。

5.染色方法

（1）采血：靜脈或毛細血管血1滴，加在距離載玻片一端1cm處。

（2）推片：左手執(zhí)載玻片，右手持推片，制成舌狀，頭、體、尾分明的血涂片。

（3）干燥：將血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。天氣寒冷或潮濕時，可置37℃溫箱中保溫促干。

（4）標記：在載玻片一端做好標記。

（5）染色：將血涂片平置于染色架上，滴加Ⅰ液3～5滴，使其迅速蓋滿血涂片，約0.5～1min后，滴加等量或稍多的Ⅱ液，輕輕搖動玻片或用吸球吹氣，使染液充分混合。

（6）沖洗：5～10min后用流水沖去染液，待干鏡檢。

6.注意事項

（1）血涂片面積太小會影響結(jié)果觀察，故應在距載玻片另一端2cm處結(jié)束涂抹為宜。

（2）血涂片干透后固定，否則細胞在染色過程中容易脫落。

（3）加染液應適量，過少易蒸發(fā)形成沉淀，使細胞不易檢查。

（4）沖洗時應以流水沖洗，不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上。沖洗時間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗。

（5）染色過淡可以復染，復染時應先加緩沖液，然后加染液。染色過深可用流水沖洗或浸泡，也可用甲醇脫色。

（二）吉姆薩染色法

1.染色原理：吉姆薩染液由天青、伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞氏染色基本相同。

2.試劑配制吉姆薩染料1.0g、甘油66ml、甲醇66ml。將染料粉末全部倒入盛有66ml甘油的圓錐燒瓶內(nèi)，在56℃水浴鍋上加熱90～120min，使染料與甘油充分溶解，然后加入60℃預熱甲醇，充分搖勻后置棕色瓶中，在室溫下靜置7d，過濾后使用。

3.染色方法

（1）同瑞氏染色（1）～（4）步驟。

（2）固定：將干燥血涂片用甲醇固定3～5min。

（3）染色：將血涂片置于用磷酸鹽緩沖液（pH6.4～6.8）稀釋10～20倍的吉姆薩染液中，浸泡10～30min。

（4）沖洗：取出用流水沖洗，待干鏡檢。