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電泳法是藥物分析學(xué)常考知識(shí)點(diǎn),為了幫助廣大執(zhí)業(yè)藥師考生復(fù)習(xí),小編為大家整理出如下相關(guān)內(nèi)容!
電泳法介紹:
電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中,于電場(chǎng)的作用下,向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng),使組分分離成狹窄的區(qū)帶,用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。
各電泳法,除另有規(guī)定外,照下述方法操作。
一、紙電泳法
1.儀器裝置
包括電泳室及直流電源兩部分。
常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個(gè)電泳槽A和一個(gè)可以密封的玻璃(或相應(yīng)材料)蓋B;兩側(cè)的電泳槽均用有機(jī)玻璃(或相應(yīng)材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機(jī)玻璃電泳槽架F,此架可從槽中取出;兩側(cè)電泳槽A內(nèi)的鉑電極D經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。
電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源,常壓電泳一般在100~500V,高壓電泳一般在500~10000V.
2.操作法
(1)電泳緩沖液
枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)
取枸櫞酸(C6H8O7·H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。
(2)濾紙
取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,備用??砂葱枰贸砷L27cm、寬18cm的濾紙,或根據(jù)電泳室的大小裁剪,并在距長度方向一端5~8cm處劃一起始線,每隔2.5~3cm處做一記號(hào)備點(diǎn)樣用。
(3)點(diǎn)樣有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。濕點(diǎn)法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中,濕潤后,取出,用濾紙吸干多余的緩沖液,置電泳槽架上,使起始線靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩沖液中,然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液,每點(diǎn)10μl,共3點(diǎn),并留2個(gè)空白位置。
干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上,吹干、再點(diǎn),反復(fù)數(shù)次,直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液,然后用噴霧器將濾紙噴濕,點(diǎn)樣處最后噴濕,本法適用于稀的供試品溶液。
(4)電泳
于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極,接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,醫(yī)學(xué)|教育網(wǎng)編輯整理調(diào)整電壓梯度為18~20V/cm,電泳約1小時(shí)45分鐘,取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。
(5)含量測(cè)定
剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙,剪成細(xì)條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時(shí),用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過,也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度,并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。
二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1)巴比妥緩沖液(pH8.6)取巴比妥2.76g,巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml.
(2)氨基黑染色液
取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3)漂洗液
取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。
(4)透明液
取冰醋酸25ml,加無水乙醇75ml,混勻。
3.操作法
(1)醋酸纖維素薄膜
取醋酸纖維素薄膜,裁成2cm×8cm的膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾于濾紙中,輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。
(2)點(diǎn)樣與電泳
于膜條上距負(fù)極端2cm處,條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2~3μl,在10~12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4~5cm為宜。[醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理]
(3)染色
電泳完畢,將膜條取下浸于氨基黑染色液中,2~3分鐘后,用漂洗液浸洗數(shù)次,直至脫去底色為止。
(4)透明
將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中10~15分鐘,取出平鋪于潔凈的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度計(jì)上測(cè)定和作標(biāo)本長期保存。
(5)含量測(cè)定
未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定,一般采用洗脫法或掃描法,測(cè)定各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)百分含量。
洗脫法
將洗凈的膜條用濾紙吸干,剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區(qū)帶,分別浸于1.6%的氫氧化鈉溶液中,振搖數(shù)次,至洗脫完全,于一定波長下測(cè)定吸收度。同時(shí)剪取與供試品膜條相應(yīng)的無蛋白部位,同法操作作對(duì)照。先計(jì)算吸收值總和,再計(jì)算各蛋白組分所占百分率。
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