【摘要】為了研究兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）中E2A-PBX1融合基因的表達(dá)，采用位于E2A基因不同位置的上游引物與下游PBX1引物，檢測了410例兒童ALL，包括362例B細(xì)胞ALL和48例T細(xì)胞ALL.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：17例患兒攜帶E2A-PBX1融合基因，檢出率4.1%，且全部為B細(xì)胞ALL，而且所有陽性病例均表達(dá)一種變異型融合轉(zhuǎn)錄本，后者是由E2A基因的第13外顯子（159bp）被差異剪切形成的。經(jīng)BLASTn比對分析，這種轉(zhuǎn)錄本保持了原來的開放閱讀框，但導(dǎo)致53個(gè)氨基酸殘基的丟失。這53個(gè)氨基酸殘基位于活化區(qū)2，會(huì)導(dǎo)致融合蛋白中部分環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)以及全部七聚體亮氨酸重復(fù)序列的丟失。結(jié)論：攜帶E2A-PBX1融合基因的兒童ALL表達(dá)典型和變異型2種融合轉(zhuǎn)錄本，后者是由E2A基因第13外顯子被差異剪切而形成的，它將導(dǎo)致融合蛋白中53個(gè)氨基酸殘基及其所構(gòu)成的部分環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)以及全部七聚體亮氨酸重復(fù)序列的丟失。

　　【關(guān)鍵詞】急性淋巴細(xì)胞白血病

　　在本研究中，我們利用兩套PCR引物，研究了兒童ALL的E2A-PBX1融合基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)所有攜帶E2A-PBX1融合基因的患兒除具有典型融合轉(zhuǎn)錄本外，全部攜帶一種變異型融合轉(zhuǎn)錄本。

　　材料和方法

　　病例從2000年12月至2004年12月我院共收治410例兒童ALL，其中包括362例B細(xì)胞ALL和48例T細(xì)胞ALL.所有患兒均行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色及免疫學(xué)檢查，部分患兒進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。我們采用多重巢式RT-PCR方法［6］在17例患兒檢出E2A-PBX1融合基因，檢出率4.1%。17例患兒中，男6例，女11例，年齡11個(gè)月到12歲，中位年齡7歲。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　方法

　　標(biāo)本抽取初診患兒的1ml骨髓液，EDTA-K2抗凝。采用紅細(xì)胞裂解液（含0.1%KHCO3、0.83%NH4Cl、0.0037%EDTA-Na2）裂解紅細(xì)胞。約106單個(gè)核細(xì)胞用于提取細(xì)胞總RNA.

　　提取細(xì)胞總RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TRIZOLReagent（購自美國Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA.利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)六聚體（購自美國Promega公司）為引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/P>

　　對照基因ABL的擴(kuò)增為避免RNA降解造成的假陰性，以ABL基因作為對照。引物序列和擴(kuò)增條件分別見參考文獻(xiàn)［7］和［8］。

　　E2A-PBX1融合基因的巢式PCR擴(kuò)增①典型融合轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增：引物序列［9］和位置。PCR擴(kuò)增條件包括：25μl反應(yīng)體系，含有10mmol/LTris·HCl（pH8.3），50mmol/LKCl，0.2mmol/LdNTPs，1.5mmol/LMgCl2，3.75pmol引物，2μlcDNA（第1輪反應(yīng)）或1μl第1輪PCR產(chǎn)物（第2輪反應(yīng)），1UTaqDNA聚合酶。93℃預(yù)變性3分鐘，93℃變性40秒，51℃退火45秒，72℃延伸40秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。②變異型融合轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增：引物序列［10］和位置。PCR擴(kuò)增條件包括：25μl反應(yīng)體系，含有10mmol/LTris-HCl（pH8.3），50mmol/LKCl，0.2mmol/LdNTP，1.32mmol/L（第1輪反應(yīng)）或1.44mmol/L（第2輪反應(yīng)）MgCl2，5pmol（第1輪反應(yīng)）或6.25pmol（第2輪反應(yīng)）引物，2μlcDNA（第1輪反應(yīng)）或1μl第1輪PCR產(chǎn)物（第2輪反應(yīng)），1UTaqDNA聚合酶。95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色按照本室的常規(guī)方法進(jìn)行。

　　PCR產(chǎn)物的測序取100μl的變異型E2A-PBX1擴(kuò)增產(chǎn)物送上海博亞公司，采用PE公司ABI377型測序儀，利用E2A-4和PBX1-4兩條引物從雙向測定DNA序列。將DNA序列輸入BLASTn進(jìn)行序列比對。

　　結(jié)果

　　E2A-PBX1融合基因和ABL基因的擴(kuò)增

　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用E2A-1、PBX1-1、E2A-2和PBX1-2進(jìn)行巢式PCR，可以獲得典型融合轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增片段［9］。我們的結(jié)果證實(shí)了上述結(jié)論，陽性片段大小為159bp。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用E2A-3、PBX1-3、E2A-4和PBX1-4進(jìn)行巢式PCR，可以獲得典型融合轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增片段，大小為376bp［10］。我們的結(jié)果除獲得376bp的陽性片段外，尚可見217bp的片段。

　　所有標(biāo)本均可見ABL基因擴(kuò)增片段。

　　變異型融合轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增片段的測序和BLASTn比對

　　將雙向測序結(jié)果加以拼接，并輸入BLASTn進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該片段是由E2A基因的第13外顯子（159bp）剪切所形成。剪切并未影響PBX1基因和開放閱讀框，因此沒有形成移碼突變。

　　討論

　　t（1；19）易位在衍生19號(hào)染色體上形成了E2A-PBX1融合基因。在mRNA水平，由E2A基因的第14外顯子和PBX1基因的第12外顯子相連接形成融合轉(zhuǎn)錄本［11］。目前已發(fā)現(xiàn)2種E2A-PBX1轉(zhuǎn)錄本，編碼2種融合蛋白，P85和P77，二者只在PBX1部分的羧基端存在差異，并都具有轉(zhuǎn)化特性，屬于癌蛋白［11］。

　　本研究發(fā)現(xiàn)的變異型融合轉(zhuǎn)錄本是由E2A基因的第13外顯子被差異剪切掉形成的，若要檢測出這種轉(zhuǎn)錄本，所用E2A引物必須位于第12外顯子及其上游。文獻(xiàn)中用于擴(kuò)增E2A-PBX1融合轉(zhuǎn)錄本的引物較多，其中E2A引物大多位于第13或14外顯子，少數(shù)位于第12與13外顯子交界處。本研究使用的E2A-1位于第12-13外顯子交界處，其3‘端有13個(gè)堿基位于第13外顯子內(nèi)，E2A-2位于第13-14外顯子交界處，其5’端有12個(gè)堿基位于第13外顯子內(nèi)，因此只能擴(kuò)增出典型融合轉(zhuǎn)錄本。而E2A-3和E2A-4均位于第12外顯子，因此能夠同時(shí)擴(kuò)增出典型和變異型兩種融合轉(zhuǎn)錄本。另一方面，測序結(jié)果也證實(shí)了變異型轉(zhuǎn)錄本的存在。綜合兩套引物的檢測結(jié)果，可以認(rèn)為所有患兒的白血病細(xì)胞都同時(shí)表達(dá)兩種融合轉(zhuǎn)錄本。至于使用E2A-3和E2A-4只在5例患兒中檢出典型融合轉(zhuǎn)錄本，其余患兒只能檢出變異型轉(zhuǎn)錄本，可能是由于我們采用的PCR條件更適于變異型轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增。

　　E2A基因是淋巴細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)基因，直接參與免疫球蛋白（Ig）基因重排，調(diào)節(jié)外周血成熟B細(xì)胞的Ig類別轉(zhuǎn)換，同時(shí)也在多個(gè)階段參與胸腺細(xì)胞的選擇與分化［12，13］。E2A蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）家族，包含2個(gè)活化區(qū)，即AD1和AD2［14-16］，E2A-PBX1融合蛋白仍保留了這兩個(gè)活化區(qū)。變異型融合轉(zhuǎn)錄本丟失了159bp，但沒有影響開放閱讀框，沒有造成移碼突變，因此仍將轉(zhuǎn)錄出融合蛋白，但丟失了53個(gè)氨基酸。值得注意的是，缺失的這53個(gè)氨基酸恰恰位于AD2區(qū)，將導(dǎo)致環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的部分丟失和七聚體亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的全部丟失［15，16］。

　　在HeLa細(xì)胞和酵母，環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)具有活化功能［16］，七聚體亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)可能參與和其它拉鏈蛋白的相互作用［15］。AD2區(qū)的完全缺失或七聚體亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的前2個(gè)亮氨酸的定點(diǎn)突變，將嚴(yán)重?fù)p害E2A蛋白的轉(zhuǎn)化功能和/或反式活化潛能［15，17］。另一方面，AD2區(qū)具有功能選擇性，其作用在胰島β細(xì)胞更為重要［15］，而AD1區(qū)在許多其它組織包括淋巴細(xì)胞中具有重要作用［14］。因此，變異型融合蛋白的功能尚需深入研究。

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