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細(xì)胞生物學(xué):Western的幾點經(jīng)驗

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  1.用脫脂奶粉封閉的效果不一定比用BSA差,不過我們試過幾種奶粉,有一些奶粉不太適合。推薦使用的奶粉:雀巢高鈣奶粉,多力精低脂奶粉。一般國產(chǎn)的奶粉的顆粒比較大,不太容易溶解。

  2.關(guān)于三名治:本人以前做時花很多時間在防止短路上,現(xiàn)在我做的時候根本沒有剪齊,最主要的是趕氣泡,這是關(guān)鍵的關(guān)鍵,其實轉(zhuǎn)膜的原理是電流的單向流動,現(xiàn)在的好多公司的轉(zhuǎn)膜裝置的電極是一個平面,所以不用擔(dān)心短路的。(不信的可以試試?。。?/P>

  3.關(guān)于轉(zhuǎn)膜時的溫度:轉(zhuǎn)膜時的溫度比較重要,最好保持在10度以下,可以用冰浴(Pharmacia的轉(zhuǎn)膜裝置),也可以在轉(zhuǎn)膜液中放入合適的事先準(zhǔn)備的冰袋(-70度>3小時)(Bio-Rad),這樣既可以降溫又可以節(jié)約Buffer. 4.關(guān)于轉(zhuǎn)膜電流和時間:一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間時間為1小時,大片段的>50KD的可以選用350mA,小片段的可以用250mA,不過本人覺得上述電流均能很好的把大部分蛋白轉(zhuǎn)過去。

  5.關(guān)于反復(fù)標(biāo)記和再標(biāo)記:一張膜上可以同時標(biāo)記很多抗體,但要注意,一般在兩個目的蛋白相差在5KD以上的,最好先后兩個抗體是不同的二抗。在兩個目的片段相差小于5KD時,就需要經(jīng)過處理,再標(biāo)記了(Re-Blot),有些公司有再標(biāo)記的現(xiàn)成試劑,不過比較貴,最簡單的方法是:ddH2O洗5分鐘,0.2MNaOH5分鐘,再用ddH2O5分鐘*3次,然后可以再標(biāo)記了。要做多個抗體的膜\的選擇,最好用PVDF或教堅固的,推薦用Amsham的Hybond-P,Hybond-Extra.本人最多在一張膜上做個10個不同的抗體。

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