【關鍵詞】 巨細胞病毒感染；抗原；病毒；腎移植；鏈菌素生物素標記法；Detection

　　【摘要】 目的建立一種新的快速診斷巨細胞病毒（CMV）感染的方法并初步用于腎移植受者。方法 采用抗CMV抗原的單克隆抗體，運用免疫組化鏈菌素-生物素標記法對外周血白細胞核中CMV抗原（即刻早期抗原和早期抗原）進行染色，診斷CMV感染。結果共檢測腎移植受者72例，CMV活動性感染率為47%（34/72），CMV病發(fā)病為18%（13/72）。CMV抗原陽性細胞數(shù)在CMV活動性感染者中平均為11.5/5萬WBC，在CMV病者為20.5±17.8/5萬WBC.同時檢測10名健康人，結果均為陰性。結論該法具有快速、簡便、成本低等優(yōu)點，且能達到定量檢測的目的，可用于臨床對CMV感染的早期快速診斷。

　　巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染在免疫功能正常的健康人極少出現(xiàn)臨床癥狀，而在免疫功能低下或缺失的患者可能會發(fā)展成有嚴重臨床癥狀的CMV?。ɑ蚍QCMV綜合征），威脅患者的生命。在腎移植受者中，由于免疫抑制劑的應用，CMV感染較為常見，約占50%或以上，其中10%～30%可發(fā)展成CMV?。?］，導致移植腎功能喪失或患者死亡。因此，對CMV感染進行早期、準確的診斷具有極其重要的意義。我們采用免疫組化鏈菌素-生物素標記（labeled streptavidin biotin，LSAB）法對外周血白細胞中CMV抗原進行染色從而診斷CMV感染，并將該方法初步應用于臨床，達到了早期、快速診斷的目的，現(xiàn)介紹如下。

　　對象與方法

　　一、研究對象

　　檢測1996年2月～1997年3月在本院接受腎移植的受者72例，其中男52例，女20例，年齡26～65歲，平均42.5歲。所有受者術后均用環(huán)孢素A＋強的松＋硫唑嘌呤（CSA＋pred＋Aza）三聯(lián)免疫抑制方案。

　　二、設備及試劑

　　普通光學顯微鏡；CMV單克隆抗體；LSAB試劑盒（購自丹麥DAKO公司，批號為K9002）；Tris堿。

　　三、CMV抗原檢測（LSAB法）

　　1.標本收集和處理：外周靜脈血3～5 ml，EDTA抗凝，離心5分鐘（500 r/min），吸取血漿層移入另一離心管。離心8～10分鐘（1000 r/min），棄去上清液，加0.83% HCl數(shù)滴，冰水中作用5分鐘，以溶解混雜的紅細胞。加大量Tris-鹽酸堿緩沖液（TBS）稀釋，離心5分鐘（600～800 r/min），棄去上清液，加適量TBS，普通光學顯微鏡下調(diào)整細胞濃度（含WBC1.0×10⁶/ml）。

　　2.細胞片制備：微量吸管吸取上述白細胞懸液50 μl（含WBC5萬個），加玻片上，面積約2 cm×2 cm大小，干燥后用4℃丙酮固定10分鐘，每例標本涂片2張。

　　3.CMV抗原染色：細胞片置0.3%H₂O₂中10分鐘（室溫），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶反應，TBS洗片。滴加1:20倍稀釋的正常豬血清阻斷劑，阻斷非特異性蛋白結合，37℃作用30分鐘，TBS洗片；滴加1:20倍用TBS稀釋的抗CMV即刻早期蛋白和早期蛋白的單克隆抗體（一抗），37℃孵育30分鐘，TBS洗片。加1:400倍稀釋的連接劑（二抗，為兔抗鼠IgG），37℃30分鐘，TBS洗片；加1:400倍稀釋的鏈菌素（streptavidin），37℃30分鐘，TBS洗片。滴加新配制的3，3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液（含TBS 5 ml+DAB5 mg+3% H₂O₂ 15 μl）顯色1～3分鐘或光學顯微鏡下控制顯色；蘇木素液淡染1～2分鐘，清水洗片。25倍物鏡觀察整張細胞片，計數(shù)陽性細胞個數(shù)。

　　4.對照設立：（1）陽性對照：用已知CMV病患者的細胞片作陽性對照。（2）陰性對照：用tBS緩沖液代替一抗或不加一抗作陰性對照。

　　結果

　　一、染色結果

　　CMV抗原陽性細胞核呈黃色或棕黃，陰性細胞核呈藍色。陽性結果以每張細胞片上（含5萬WBC）陽性細胞總數(shù)（抗原指數(shù)）表示。

　　二、病例檢測結果

　　72例中，抗原陽性者共34例（47%），陽性細胞數(shù)為2.0～64.0/5萬WBC，平均11.5/5萬WBC.其中10.0～30.0/5萬WBC者16例（占47%），＞30.0/5萬WBC者5例（占15%）。

　　34例抗原陽性者中，有癥狀的CMV病者13例（38%），陽性細胞數(shù)5.0～64.0/5萬WBC，平均20.5±17.8/5萬WBC，其中10.0～30.0/5萬WBC者7例，＞30.0/5萬WBC者4例。

　　21例無癥狀抗原陽性者，陽性細胞數(shù)為2.0～42.0/5萬WBC，平均8.0±9.9/5萬WBC.

　　應用本法檢查10名血清學陰性的健康人，結果均為陰性。

　　討論

　　1.目前診斷CMV感染常用方法有抗體檢查、病毒培養(yǎng)、聚合酶鏈反應（PCR）、病毒核酸雜交等，但都存在不足，難以滿足臨床需要。如抗體檢查，由于用免疫抑制劑后，部分患者可無抗體反應或反應延遲而影響陽性率；病毒培養(yǎng)法繁瑣，費時長（1周以上），并且易受細菌、霉菌等生長所污染，目前已很少應用；病毒核酸雜交技術難度較大且復雜，難以普及應用；而PCR檢查也易受多因素影響，并且由于敏感度高可能檢測出隱性感染者或出現(xiàn)假陽性。此外，上述方法均不能做到定量檢測?；谏鲜鲆蛩兀瑓⒄諊獾膶嶒灒?］并作適當?shù)母倪M（用LSAB法代替ABC法），我們對外周血白細胞中CMV抗原進行檢測（LSAB法），避免了上述方法的不足，對CMV感染能做出快速的診斷。

　　2.CMV感染細胞后可在細胞核內(nèi)表達即刻早期、早期和晚期蛋白（即病毒抗原）。即刻早期蛋白屬磷酸蛋白，分子量為65 000，通常在病毒感染細胞后3～4小時即開始合成，并在以后的病毒基因表達中起著重要的作用；早期蛋白在其后稍晚合成［3］。兩者均屬病毒復制調(diào)控蛋白，其存在提示病毒呈活動狀態(tài)。CMV抗原測定即是利用針對即刻早期蛋白的單克隆抗體，運用免疫組化染色的方法對感染細胞核進行染色，可以直接反映外周血中有無活動性CMV感染。而隱性感染者CMV潛伏無復制，故無病毒蛋白表達，抗原染色為陰性。本研究對10名健康人檢查結果均為陰性。CMV抗原最早在感染后數(shù)小時即可檢測出來，可用于早期診斷。

　　3.目前國外文獻報道的CMV抗原檢測通常采用ABC法或免疫熒光檢測法［2，4］。ABC免疫組化法的缺點是常難避免內(nèi)源性過氧化物酶的非特異性染色而致假陽性。我們采用LSAB免疫組化法的優(yōu)點是過氧化酶直接結合在鏈菌素分子上，形成鏈菌素過氧化酶復合物，比ABC法中的卵白素-生物素-過氧化酶復合物分子量小，在組織中具有更強的穿透力；其次是因為鏈菌素與生物素的化學親和力比卵白素更強，能與第二抗體更迅速牢固地結合，因而敏感性大大增加，且染色前我們用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用正常豬血清阻斷劑阻斷了非特異性蛋白結合而使假陽性率降低［5］。LSAB法的另一優(yōu)點是染色背景清晰，染色時間（僅5～6小時）較ABC法（約8～12小時）大大縮短。免疫熒光法的缺點是需要熒光顯微鏡、且易受雜質(zhì)污染而影響判斷。LSAB法無需熒光顯微鏡，普通顯微鏡即可。我們發(fā)現(xiàn)只要染色時間控制恰當，均能得到滿意的效果，陰性細胞和陽性細胞具有明顯區(qū)別，易于判斷。

　　4.免疫組化法抗原檢測還可以做到定量檢測，這對CMV感染的診斷和治療具有重要的指導意義。CMV抗原指數(shù)是反映體內(nèi)病毒數(shù)量（即病毒“負荷”）的較好指標，CMV病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸和體內(nèi)病毒“負荷”有一定的相關性［6］?？乖笖?shù)高或升高迅速，常提示為CMV病，低抗原指數(shù)或抗原指數(shù)穩(wěn)定者多為無癥狀活動性感染。本組CMV病者中平均抗原指數(shù)為20.5±17.8/5萬WBC，而無癥狀者為8.0±9.9/5萬WBC，兩組比較差異有顯著性。我們還發(fā)現(xiàn)，隨著CMV感染治療的好轉(zhuǎn)，抗原指數(shù)也逐漸下降，治療無效者抗原指數(shù)變化不大或增高。此時可能為藥物劑量不足或病毒耐藥。本組13例CMV病者經(jīng)治療8例痊愈，抗原指數(shù)均下降，其中6例轉(zhuǎn)陰；而5例死亡者中2例抗原指數(shù)居高不下，3例下降緩慢，經(jīng)調(diào)整藥物劑量或更換藥物后，3例抗原指數(shù)下降，后因其他并發(fā)癥死亡，2例無效。值得注意的是，CMV病不僅與病毒負荷相關，還受其他因素如機體免疫水平、一般狀況、及是否伴發(fā)其他感染或排斥等影響，因此，少數(shù)抗原指數(shù)高者可能并無臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，如本組病例中有抗原指數(shù)為42.0/5萬WBC時仍無臨床疾病表現(xiàn)者，而有的則抗原指數(shù)僅為5.0/5萬WBC即有明顯癥狀。因此，僅靠CMV抗原指數(shù)診斷CMV病應慎重。本組結果表明，抗原指數(shù)為10.0～30.0/5萬WBC者對CMV病的陽性預測值僅為43.8%（7/16），＞30.0/5萬WBC時陽性預測值是4/5.72例中有CMV病者13例，抗原檢測均陽性，該法診斷CMV病敏感性為100%（13/13）。

　　cMV抗原檢測方法需時較短，一般僅需5～6小時，無需昂貴設備，在普通實驗室即可開展，且成本較低，不失為一種快速、簡便、準確而敏感性高的診斷CMV感染的方法，目前國內(nèi)尚未開展，值得推廣應用。

　　參考文獻

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　　5吳惠茜，林漢良，宗永生。免疫組織化學LSAB和ABC法敏感性比較。中山醫(yī)科大學學報，1993，14：117-119.

　　6 The TH， van den Berg AP， van Son WJ， et al. Monitoring for cytomegalovirus after organ transplantation： a clinical perspective. Transpl ant Proc，1993，25：5-9.