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酶活性測(cè)定方法-生化檢驗(yàn)

2013-06-15 10:16 來(lái)源:
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酶活性測(cè)定方法:

1.按反應(yīng)時(shí)間分類法:

20世紀(jì)50年代以前大都使用固定時(shí)間法。這種方法是以酶催化反應(yīng)的平均速度來(lái)計(jì)算酶的活性,現(xiàn)多已不用。50年代中期開始采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法。這種方法用自動(dòng)生化分析儀上完成,可以測(cè)酶反應(yīng)的初速度醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理,其結(jié)果遠(yuǎn)比固定時(shí)間法準(zhǔn)確,在高濃度標(biāo)本尤為明顯,但本法也受到反應(yīng)時(shí)間,反應(yīng)溫度,試劑等的影響,應(yīng)加以注意。

(1)定時(shí)法:(兩點(diǎn)法)

通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開始后某一時(shí)間段內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來(lái)求取酶反應(yīng)初速度的方法。其中t1往往取反應(yīng)開始的時(shí)間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時(shí)間醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理,通過(guò)加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等,使反應(yīng)完全停止(也叫中止反應(yīng)法)。加入試劑進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)呈色測(cè)出底物和產(chǎn)物的變化。

該法最基本的一點(diǎn)是停止反應(yīng)后才測(cè)定底物或物的變化。

優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)單易行,對(duì)試劑要求不高。

缺點(diǎn):難保證測(cè)定結(jié)果的真實(shí)性。

難以確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。隨著保溫時(shí)間的延續(xù),酶變性失活加速。

(2)連續(xù)監(jiān)測(cè)法:又稱為動(dòng)力學(xué)法或速率法、連續(xù)反應(yīng)法。

在酶反應(yīng)過(guò)程中,用儀器監(jiān)測(cè)某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物濃度隨時(shí)間的變化所發(fā)生的改變,通過(guò)計(jì)算求出酶反應(yīng)初速度。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法根據(jù)連續(xù)測(cè)得的數(shù)據(jù),可選擇線性期的底物或產(chǎn)物變化速率用于計(jì)算酶活力。

因此連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性比定時(shí)法更準(zhǔn)確。

實(shí)際工作中,采用工具酶的酶偶聯(lián)法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣、最頻繁測(cè)酶活性濃度的方法。

(3)平衡法:通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量來(lái)求出酶活力的方法,又叫終點(diǎn)法。

2.按檢測(cè)方法分類法:

①分光光度法;②旋光法;③熒光法;④電化學(xué)方法;⑤化學(xué)反應(yīng)法;⑥核素測(cè)定法;⑦量熱法。

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